單一pH法、pH示差法和差減法快速測(cè)定干紅葡萄酒中總花色苷含量的比較

翦 祎，韓舜愈，張 波，祝 霞，王 婧，崔日寶

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

花色苷為花色素的糖苷，是紅葡萄酒中主要的呈色物質(zhì)，決定了酒的品質(zhì)。在整個(gè)釀造過(guò)程中，葡萄中的花色苷會(huì)因?yàn)轷惨盒再|(zhì)的變化而發(fā)生一定的變化，同時(shí)，花色苷還具有抗氧化，抗突變、抗癌，保護(hù)心血管及神經(jīng)系統(tǒng)，改善視力等多種生理功能［1］。因此，對(duì)葡萄酒中花色苷進(jìn)行研究對(duì)于葡萄酒生產(chǎn)工業(yè)具有十分重要的意義。目前，常用的總花色苷的定量方法有高效液相色譜法和可見(jiàn)分光光度法。其中，高效液相色譜法定量測(cè)定花色苷含量精確度雖高，但設(shè)備儀器較昂貴，需要多種花色素標(biāo)準(zhǔn)品［2］，而分光光度法不需用花色苷標(biāo)準(zhǔn)品，且和HPLC具有高的相關(guān)性［3］，這使得可見(jiàn)分光光度法成為一種切實(shí)可行的檢測(cè)方法［4］。目前常用的分光光度法包括:pH示差法、單一pH法和差減法。研究發(fā)現(xiàn)，花色苷的結(jié)構(gòu)隨pH改變有幾種不同形式的轉(zhuǎn)變，其結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是pH的函數(shù)，而干擾物的特征光譜不隨pH的改變而變化［5］。在pH示差法測(cè)定中，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，確定兩個(gè)對(duì)花色苷吸光度差別最大，但可保持其穩(wěn)定的pH，測(cè)定這兩個(gè)pH處的吸光值差異，根據(jù)公式就可以計(jì)算出花色苷的總量［6］。同時(shí)，在pH方法中，花色苷總量測(cè)定也可在一個(gè)恒定的pH介質(zhì)條件下進(jìn)行，此方法稱為單一pH法。該方法在很少含有在花色苷的最大吸收區(qū)發(fā)生吸收的干擾物質(zhì)的樣品中，利用朗伯-比耳定律通過(guò)適當(dāng)波長(zhǎng)處的吸光度來(lái)測(cè)定［7］，由于操作簡(jiǎn)便，被廣泛應(yīng)用于花色苷含量的測(cè)定［8］。此外，酒中的花色苷可被二氧化硫或亞硫酸鹽等物質(zhì)漂白，漂白后其在可見(jiàn)光的光譜特征消失，而酒中花色苷的干擾物吸光度則很少受影響。利用葡萄酒樣品漂白前后吸光度的差值，參考標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，便可計(jì)算出相應(yīng)的含量［7］。本文以干紅葡萄酒為實(shí)驗(yàn)原料，討論分光光度法測(cè)定干紅酒總花色苷含量的分析條件，并比較各方法之間的差異，以期為葡萄酒中的總花色苷含量檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)單有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干紅葡萄酒 市售;錦葵色素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)草藥藥典公司;鹽酸、氯化鉀、乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、亞硫酸鈉 分析純，天津光復(fù)科技有限公司。

pH為0.5～2.0的緩沖溶液(0.1mol/L檸檬酸溶液逐滴加入鹽酸，pH計(jì)校正配制);pH1.0的緩沖溶液(0.2mol/L KCl∶0.2mol/L HCl=25∶67，v/v);pH4.5的緩沖溶液(0.2mol/L NaAc·3H2O∶0.2mol/L HAc=1∶1，v/v);pH 為3.0～6.0 的緩沖溶液(0.1mol/L 檸檬酸和0.1mol/L檸檬酸鈉，pH計(jì)校正配制)。

UV756CRT紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;CP214型電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋 恒豐儀器制造有限公司;Metrohm 827 pH Lab pH計(jì) 瑞士萬(wàn)通公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 由于本研究的樣品是葡萄酒，其花色苷組成很復(fù)雜，可以選擇標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)表示干紅酒樣中花色苷的含量，以錦葵色素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)表示［9］。

將錦葵色素-3-葡萄糖苷用pH1.0的緩沖液配制成25mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其吸光值在分光光度計(jì)的線性范圍內(nèi)(0.2～1.4AU)［9］，在 200～800nm 下進(jìn)行全波段(光譜)掃描，確定最大測(cè)定吸收波長(zhǎng)。空白對(duì)照用pH1.0的緩沖溶液。

1.2.2 錦葵色素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將錦葵色素-3-葡萄糖苷用pH1.0的緩沖液分別配制成 5、10、15、20、25、30mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。空白樣品在用緩沖液定容前加入0.5mL 10%亞硫酸鈉溶液。在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 pH示差法測(cè)定條件的選定

1.2.3.1 pH的選定 為使pH示差法有較好的靈敏度及準(zhǔn)確性，pH的選定對(duì)花色苷的定量分析具有重要的意義，由于花色苷只有在酸性介質(zhì)中是穩(wěn)定的，因此只測(cè)定pH小于7條件下花色苷吸光值的變化［10］。

分別吸取1mL樣品于9個(gè)試管中，再分別加入pH 為 0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的緩沖溶液9mL，平衡120min后，以蒸餾水為空白對(duì)照，于最大波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.3.2 平衡時(shí)間的確定 因?yàn)榛ㄉ赵谌芤航橘|(zhì)中存在4種結(jié)構(gòu)形式，這4種結(jié)構(gòu)形式在某一pH下處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)pH改變時(shí)，動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生轉(zhuǎn)移，總的趨勢(shì)是:pH降低時(shí)，平衡向紅色的2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子移動(dòng);pH升高時(shí)平衡向藍(lán)色醌式移動(dòng)，一定時(shí)間后達(dá)到一個(gè)新的平衡。因此，樣品用緩沖液稀釋后，須靜置一段時(shí)間，等穩(wěn)定后才能測(cè)定［10］。

吸取樣品1mL，再加入pH為1.0的緩沖溶液9mL，以蒸餾水為空白在室溫下分別平衡10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min，于最大波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。用同樣的方法測(cè)pH為4.5的緩沖溶液的平衡時(shí)間。

1.2.4 pH示差法測(cè)總花色苷含量 分別吸取葡萄酒 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，用 pH 1.0的緩沖液定容至10mL。室溫平衡100min后，以蒸餾水為空白，分別在最大吸收波長(zhǎng)和700nm處測(cè)定吸光值。用同樣的方法測(cè)樣品在pH為4.5的緩沖溶液中的吸光度值。

1.2.5 單一pH法測(cè)總花色苷含量 分別吸取葡萄酒 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，用 pH 1.0的緩沖液定容至10mL。室溫平衡100min后，以蒸餾水為空白，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.2.6 差減法測(cè)總花色苷含量 分別吸取葡萄酒0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，用 pH1.0 的緩沖液定容至10mL。室溫平衡100min后，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。樣品的漂白處理是取相同量的葡萄酒在定容前加入0.8mL 20%的Na2SO3溶液。

1.2.7 經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算方法 pH示差法［9］:花色苷色素含量(mg/L-A700nm)pH1.0-(Aλmax-A700nm)pH4.5;MW(分 子 量)=493.2g/mol(錦葵色素-3-葡萄糖苷);DF=稀釋倍數(shù);1=光程的厘米數(shù);ε=28000摩爾消光系數(shù)(錦葵色素-3-葡萄糖苷)單位是L· mol-1·cm-1。

單一 pH 法［11］:

式中:A=Aλmax;其他與pH示差法相同。

差減法［7］:

式中:A1和A2分別為亞硫酸鈉漂白前后的溶液吸光度;k為采用錦葵色素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

利用可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行全波段掃描，掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。由資料可知，花色苷的最大吸收區(qū)通常在500～550nm［12］范圍內(nèi)，故錦葵色素-3-葡糖苷的最大吸收峰波為521nm。

圖1 錦葵色素-3-葡萄糖苷光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of alvidin-3-glucoside

2.2 錦葵色素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

在最大吸收波長(zhǎng)521nm下，檢測(cè)不同濃度錦葵色素-3-葡萄糖苷的吸光值，如圖2所示，其線性方程為y=0.0425x-0.0067，線性相關(guān)系數(shù)R為0.9989。

2.3 pH示差法測(cè)定條件的選定

圖2 錦葵色素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of alvidin-3-glucoside

2.3.1 pH的選定 根據(jù)示差法測(cè)定的原理，對(duì)pH進(jìn)行選擇。在選擇時(shí)應(yīng)考慮以下三個(gè)因素:a.兩個(gè)不同pH處測(cè)定的花色苷吸光值差異應(yīng)最顯著;b.單一pH的輕微變動(dòng)，對(duì)花色苷吸光值的影響較小;c.花色苷在兩個(gè)pH下應(yīng)相當(dāng)穩(wěn)定［13］。根據(jù)以上的因素，結(jié)合圖3數(shù)據(jù)可知，葡萄酒花色苷在pH為1.0和4.5處時(shí)吸光度的差值最大，并且在此兩處pH附近吸光度變化較小，因此選擇1.0和4.5為示差法測(cè)定花色苷的pH。

圖3 樣品在不同pH下測(cè)定的吸光值Fig.3 Absorbance value of samples under different pH

2.3.2 平衡時(shí)間的確定 圖4和圖5分別反映pH為1.0和4.5時(shí)，干紅葡萄酒在不同時(shí)間下吸光度的變化情況。結(jié)果表明，葡萄酒中的花色苷在緩沖液中的吸光度值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而變化，并呈現(xiàn)不同的趨勢(shì)。在pH1.0的緩沖液中，花色苷的吸光值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，在100min時(shí)基本穩(wěn)定。在pH4.5的緩沖液中，花色苷的吸光值隨時(shí)間的延長(zhǎng)而快速下降，在50min時(shí)趨于穩(wěn)定。因此，根據(jù)上述的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合考慮，平衡時(shí)間選擇為100min。

圖4 樣品吸光度隨時(shí)間的變化(pH=1.0)Fig.4 Change of sample absorbance with time

2.4 三種測(cè)定方法的比較

經(jīng)測(cè)算由經(jīng)驗(yàn)公式［9］得葡萄酒花色苷含量為231.8mg/L，在葡萄酒總花色苷濃度的線性范圍內(nèi)，將原液分別稀釋為10到100倍。

圖5 樣品吸光度隨時(shí)間的變化(pH4.5)Fig.5 Change of sample absorbance with time

圖6 pH示差法測(cè)總花色苷的含量Fig.6 Determination of total anthocyanins by pH-differential method

圖7 單一pH法測(cè)總花色苷的含量Fig.7 Determination of total anthocyanins by single pH method

由圖6～圖8可知，當(dāng)用pH示差法、單一pH法及差減法測(cè)定干紅葡萄酒中總花色苷濃度時(shí)，其相關(guān)系數(shù)均接近 1(R分別為 0.9977，0.9988和0.9984)，表明變量之間的線性相關(guān)程度較高，可見(jiàn)這3種方法能比較準(zhǔn)確的測(cè)定干紅酒中總花色苷含量。

圖8 差減法測(cè)總花色苷的含量Fig.8 Determination of total anthocyanins by substraction method

2.5 三種方法測(cè)定結(jié)果的差異性

用DPS軟件，采用Bonferroni測(cè)驗(yàn)比較3種方法的差異性(表1)。由表中數(shù)據(jù)可知，三種方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差均較低，說(shuō)明方法的重現(xiàn)性較高，且各方法之間置信區(qū)間均包括0，故3種處理方法的差異不顯著(p＜0.05)。

表1 三種方法測(cè)定結(jié)果的差異性比較Table 1 Comparison of difference between the results of three methods

3 結(jié)論

3.1 用分光光度法測(cè)定干紅葡萄酒中的花色苷含量，最大吸收波長(zhǎng)為521nm。

3.2 在pH示差法測(cè)定中，選擇pH1.0、pH4.5和室溫下平衡100min為其測(cè)定的條件。

3.3 單一pH法、pH示差法和差減法測(cè)定溶液的吸光度與花色苷濃度的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R分別為0.9988、0.9977 和0.9984。

3.4 通過(guò)Bonferroni檢驗(yàn)表明三種方法的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著性差異(p＜0.05)，均可用于干紅葡萄酒中總花色苷含量的測(cè)定。

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