丁香精油對櫻桃番茄保鮮作用的研究

潘磊慶，朱 娜，邵興鋒，江琳琳，屠 康，*

(1.南京農業大學食品科技學院，農業部農畜產品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇南京210095;2.寧波大學食品科學與工程系，浙江寧波315211;3.青島流亭機場海關，山東青島266041)

櫻桃番茄又名圣女果、小番茄，既是蔬菜又是水果，色澤艷麗，美味可口，其維生素含量是普通番茄的1.7倍［1］，且是人類膳食中番茄紅素的主要來源［2］，豐富的營養使其深受消費者青睞。目前果蔬保鮮方法主要有低溫保鮮法、氣調保鮮法和化學保鮮法等，但存在一些不足，如低溫冷藏可能導致果蔬產生冷害，且能耗較高;氣調保鮮對設備要求較高，且氣體組分的波動影響保鮮效果;化學試劑處理易造成環境污染等問題。隨著社會經濟的發展，人們對食品安全的關注程度越來越高，尋找高效、無毒的安全保鮮劑正受到越來越多的關注，植物精油類防腐保鮮劑是用于果蔬保鮮研究的一個研究熱點［3-5］。丁香是桃金娘科植物丁香的干燥花蕾，既是香料又是一味中藥，具有抑菌作用。丁香中的抑菌物質主要是丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯、水楊酸甲酯、苯甲醛等，有特殊的香味，易揮發，無殘留［6］。國內已有學者研究了丁香精油對果蔬的保鮮效果［7-9］。本文主要研究了丁香精油熏蒸處理對櫻桃番茄采后主要致病菌的抑制作用及對其采后品質和生理的影響，以期為丁香精油用于櫻桃番茄的保鮮提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

病原菌 由灰葡萄孢霉引起的灰霉病、匍枝根霉引起的軟腐病是造成櫻桃番茄采后損失的主要原因［2］，本實驗采用的灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer(Ehrenb.)Lind)分離于自然發病的櫻桃番茄果實，并置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上保藏，使用前在自制培養(MDA)基上于20℃活化7d;培養基(MDA)30%櫻桃番茄汁+1%葡萄糖+1.5%瓊脂粉;丁香精油 吉安市林源香料有限公司，相對密度為1.044～1.057，折射率為1.528～1.538，丁香酚含量85%，精油可完全揮發;櫻桃番茄果實 采自江心洲精品果園，2h內運至實驗室，選擇八成熟、無病蟲害和機械損傷的果實進行實驗。

PYX-250H-A型恒溫恒濕培養箱 廣東韶關科力實驗儀器有限公司;GL-20G-II型冷凍高速離心機 上海安亭科學儀器廠;TD-45型數字折光儀浙江托普儀器有限公司;UV1102型紫外分光光度計上海天美儀器有限公司;Minolta CR-200型色彩色差儀 日本Minolta公司;610型pH計 新加坡Trans-Wiggens。

1.2 實驗方法

1.2.1 精油抑菌率的測定 用無菌打孔器在培養基上取直徑為5mm的灰霉或根霉菌塊放入MDA平板上，取直徑為7mm的無菌濾紙片放在平板蓋子中央，用移液器添加一定量精油于濾紙上，使精油揮發物最終濃度分別達到 50、100、200、400、800μL/L，每個濃度3個平板，實驗重復3次，以不加精油為對照，迅速用保鮮膜密封于28℃培養7d后觀察結果，用十字交叉法測量菌落生長直徑。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)×100/(對照菌落直徑-5mm)

1.2.2 果實處理方法 將果實置于2L塑料盒內，每處理35個，用移液器向粘貼于盒蓋的濾紙上添加一定量的丁香精油，使盒內最終精油揮發物濃度分別達到20、70、120、170、220μL/L，以不添加精油組為對照，立即用保鮮膜密封，置于20℃、相對濕度90%恒溫箱中貯藏，貯藏7d后每2d取樣測定指標，測定重復3次。

1.2.3 生理及品質指標測定

1.2.3.1 過氧化物酶(POD)活性的測定 采用愈創木酚法［10］。取2g去皮果肉，加5mL 0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH6.4，含3%聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨勻漿，4℃、12000r/min離心20min，取上清液測定酶活性。

1.2.3.2 多酚氧化酶(PPO)活性的測定 采用鄰苯二酚法［11］，樣品處理方法同 1.2.3.1。

1.2.3.3 過氧化氫酶(CAT)活性的測定 參照Wang等［12］的方法并加以改進:取1g去皮果肉，加 5mL 0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0，含3%聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨勻漿，4℃、12000r/min離心20min，取上清液測定酶活性。反應體系:0.2mL粗酶提取液+3mL磷酸緩沖溶液+0.2mL0.75%H2O2，掃描3min內OD240的變化，以每分鐘240nm處吸光值下降0.001作為一個酶活單位(U)，酶活性以U·g-1FW表示。

1.2.3.4 腐爛指數 貯藏結束后統計不同處理組的腐爛指數。

腐爛指數(%)=∑(腐爛等級×該等級果數)/(最高腐爛等級×調查總果數)×100

腐爛等級按腐爛面積占果實表面積的百分比劃分:0級，無腐爛;1級，［0，25%］;2級，(25%，50%］;3 級，(50%，75%］;4 級，(75%，100%］。

1.2.3.5 可滴定酸的測定 采用電位滴定法。

1.2.3.6 可溶性固形物含量 用TD-45數字折光儀測定。

1.2.3.7 硬度 用FT 327硬度計測定。

1.2.3.8 色澤 用CR-200色差計測定。

1.4 數據分析

數據分析和處理利用SAS 8.2實現。

2 結果與分析

2.1 丁香精油的抑菌率

丁香精油對病原菌的抑制率見表1。從表1可以看出，丁香精油對灰霉菌的抑制率隨著精油濃度的增加而提高，在濃度為800μL/L時對灰霉菌的抑制率達92.45%。丁香精油對根霉菌生長的抑制作用極為顯著，在50μL/L時根霉菌菌絲生長已被完全抑制，且各處理組均無菌絲生長。因此，丁香精油可以有效抑制櫻桃番茄主要病原菌的生長。

表1 丁香精油對病原菌的抑菌率Table 1 Inhibitory rate of clove oil against pathogens

2.2 丁香精油對櫻桃番茄防御性酶活性的影響

2.2.1 過氧化物酶(POD)POD屬于PR蛋白的PR-9家族，在木質素生物合成的最后一步中催化H2O2分解而發揮作用［13］。在機體受到脅迫時酶活性增強起到保護作用，但是當脅迫達到一定程度時酶活性逐漸減弱，此時機體瀕臨死亡。如表2所示，在貯藏期的前7d，所有處理組果實的POD活性變化不大，在第11d出現峰值，第15d出現另一個活性高峰。在整個貯藏期內，經丁香精油處理的櫻桃番茄POD活性均高于對照，且120μL/L丁香精油對POD活性的誘導作用最強，其次為70μL/L和170μL/L。

2.2.2 多酚氧化酶(PPO)PPO除了是引起果蔬褐變的主要因素外，在植物抗病反應中也發揮著重要作用，其機理為:通過催化木質素及其它酚類物質的氧化產生保護性屏障而抵抗病菌的入侵［14］。從圖1可以發現，在貯藏前期，濃度為20、70、120μL/L的丁香精油可誘導櫻桃番茄果實PPO活性的提高，活性高峰出現在第7d，較對照提前4d且峰值高于對照。在貯藏后期，處理組PPO活性始終高于對照。經170、220μL/L的高濃度精油處理后，果實PPO活性有被抑制的趨勢。由此可見，適宜濃度的丁香精油可增強櫻桃番茄果實PPO的活性并且誘導活性高峰的提前出現，而濃度過高對PPO活性有抑制作用。貯藏后期酶活性的急劇升高可能與果實衰老腐爛有關［2］。

圖1 丁香精油對櫻桃番茄果實PPO活性的影響Fig.1 Effect on PPO activity of cherry tomatoes by clove oil

2.2.3 過氧化氫酶(CAT)CAT通過作用于H2O2，參與活性氧的代謝［2］。果實體內的活性氧具有雙重作用，當果實處于溫和環境中時活性氧升高會加速果實的衰老，當果實遭遇逆境時，H2O2能夠作為底物參與細胞壁蛋白的快速氧化交聯和木質化，使病原菌更難穿透細胞壁，并且可以作為二級信號分子激發植物抗病性基因的表達，比如編碼葡聚糖酶和幾丁質酶等病程相關蛋白［15］。不同處理對櫻桃番茄CAT活性的影響如圖2所示，在貯藏期間櫻桃番茄果實CAT活性逐漸上升，達到峰值后迅速下降，丁香精油處理組CAT活性均高于對照。120μL/L的精油處理可誘導CAT活性高峰的提前出現，且峰值高于其他處理。在櫻桃番茄果實貯藏前期，相對于對照組而言，精油處理組果實可以更好的清除體內活性氧，維持活性氧代謝平衡;而在果實貯藏中后期，各組果實細胞中開始積累H2O2，以增強對于病原菌侵染的防御能力。

2.3 丁香精油對果實貯藏品質的影響

2.3.1 丁香精油對腐爛指數的影響 采后腐爛是果實采后保鮮面臨的一個嚴峻的問題。果實的采后腐爛是一個逐漸的過程，病斑的擴大由小到大，因此，使用腐爛指數比腐爛率更能客觀的反映出所采用的保鮮劑的防腐保鮮效果，其結果也更科學［7］。不同處理條件下貯藏結束時櫻桃番茄腐爛指數如圖3所示。貯藏結束時對照組腐爛指數為85.3%，處理濃度小于120μL/L時腐爛指數隨濃度升高而降低，當處理濃度大于120μL/L時腐爛指數隨濃度升高而變大，120μL/L精油處理時腐爛指數最低，為25.1%。精油濃度較低時熏蒸處理不足以殺死果實上存在的全部病原菌，而當處理濃度達到170μL/L及以上時，熏蒸處理影響了果實正常的生理活動，這可能是產生處理組果實腐爛指數先降低后升高的原因。從對腐爛指數的影響來看，適宜的精油處理濃度為120μL/L。

表2 丁香精油對櫻桃番茄果實POD活性的影響Table 2 Effect on POD activity of cherry tomatoes by clove oil

圖2 丁香精油對櫻桃番茄果實CAT活性的誘導Fig.2 Effect on CAT activity of cherry tomatoes by clove oil

圖3 丁香精油對櫻桃番茄腐爛指數的影響Fig.3 Effect on the index of rotted of cherry tomatoes by clove oil

2.3.2 丁香精油對櫻桃番茄貯藏品質的影響 分別于貯期結束時測定對照組和丁香精油處理組完好櫻桃番茄果實的硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸和果實顏色。果實顏色變化用L*、C*、H三個數值表示，其中，L*表示亮度，其值在0～100之間，L*=0表示黑色，L*=100表示白色;C*為彩度，即飽和度，表示顏色的鮮艷程度，即純色與非純色的程度，在亮度(L*)相同的條件下，該值越大，顏色越鮮艷;H為色調角，綜合表示色彩分布情況，H 值在0～45°之間表示紅色，在135～180°之間表示顏色介于黃綠到綠色之間。

結果如表3所示，櫻桃番茄在20℃下貯藏19d之后，精油處理組的果實硬度、可溶性固形物含量及可滴定酸與對照組果實均無顯著差異(α=0.05)。無論對照組果實還是精油處理組果實，其果皮顏色的L*值始終處在37～41之間變化;C*值變化范圍為23～30;H值均在37～44°之間，這表示此時櫻桃番茄果實顏色是紅色;精油處理組與對照組櫻桃番茄的果實顏色無顯著差異(α=0.05)。精油處理組和對照組的果實品質并無顯著差異(α=0.05)，因此，適宜濃度的丁香精油熏蒸櫻桃番茄不會對其貯藏品質產生顯著影響。

表3 丁香精油對櫻桃番茄貯藏品質指標的影響Table 3 Effect on the quality of cherry tomatoes by clove oil

3 結論與討論

天然、無毒、具有抑菌活性的植物精油具有巨大的應用潛力，但其抑菌機理目前還沒有明確的結論，一般認為是精油中的疏水性成分與微生物細胞膜相互作用，破壞膜的完整性導致細胞內容物泄漏、質子動力損耗及細胞質凝結，從而產生對微生物的致死作用［16］。本文首先研究了丁香精油對櫻桃番茄主要病原菌的離體抑制作用，證實了丁香精油的抑菌效果，揭示了丁香精油用于櫻桃番茄防腐保鮮的潛力，然后通過對貯藏期各項指標的研究探討了精油保鮮櫻桃番茄的效果。實驗結果表明，丁香精油處理通過抑制灰霉和根霉的生長，誘導果實防御性酶活性的提高實現了對櫻桃番茄的保鮮作用。處理濃度為120μL/L時保鮮效果最好，貯藏19d后腐爛指數比對照降低了70.6%，在α=0.05水平上該處理組的果實硬度、色澤、可溶性固形物含量及可滴定酸與對照組果實無顯著差異。

本實驗結果顯示丁香精油可以有效抑制灰葡萄孢及匍枝根霉的離體生長，誘導櫻桃番茄防御酶活性的提高，但當濃度過高時對果實產生了毒害作用，且研究表明精油處理對果實呼吸作用幾乎沒有影響［7］，不能有效延緩果實的衰老，而涂膜處理可以調節果蔬的呼吸及蒸騰作用，從而延緩果蔬的衰老過程［17］，因此，探討丁香精油與涂膜保鮮等其他保鮮手段的結合效果具有現實意義，可作為進一步研究的方向。

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