玉屏風(fēng)散傳統(tǒng)飲片湯劑與配方顆粒湯劑對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能影響的比較

樊凱芳，趙建平，馮振宇

（1.山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原030024； 2.山西中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西 太原030013）

湯劑作為傳統(tǒng)中藥劑型，雖具有吸收快、療效好、能隨癥加減等優(yōu)點(diǎn)，但亦有服用攜帶不便、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不明等缺點(diǎn)。中藥配方顆粒是以符合炮制規(guī)范的優(yōu)質(zhì)藥材為原料，采用現(xiàn)代高新技術(shù)提取、濃縮、制粒而成的產(chǎn)品系列，具有可直接沖服、使用及攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，在臨床使用逐漸增多。玉屏風(fēng)散出自于朱丹溪《丹溪心法》，由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)組成，具有益氣固表、祛風(fēng)止汗、扶正固本功效，廣泛應(yīng)用于臨床各科。現(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證實(shí)，玉屏風(fēng)散具有調(diào)節(jié)、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，包括特異性免疫、非特異性免疫等。為給中藥配方顆粒替代中藥飲片提供依據(jù)，本研究通過實(shí)驗(yàn)，將玉屏風(fēng)散傳統(tǒng)飲片湯劑與配方顆粒湯劑對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小白鼠，6 w～8 w，體重（20±2）g，雌雄各半。由中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供。生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk20090017。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成，中藥飲片、配方顆粒（由同批次相應(yīng)飲片制備而成），均由廣州一方制藥有限公司提供；傳統(tǒng)飲片湯劑（黃芪 30 g，白術(shù) 30 g，防風(fēng) 15 g，共計(jì) 75 g/d）按傳統(tǒng)煎煮法做成水煎液，并濃縮至含生藥0.25 g/mL，0.5 g/mL，1 g/mL 3種濃度。配方顆粒湯劑：取與飲片劑量相當(dāng)?shù)呐浞筋w粒（黃芪顆粒6 g，白術(shù)顆粒9 g，防風(fēng)顆粒3 g），加80℃～100℃的水配制成相應(yīng)的濃度（同傳統(tǒng)飲片組）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 JA5003型電子分析天平（上海精科天平廠）；UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津）；DDL-5冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；B×60型顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 環(huán)磷酰胺（上海華聯(lián)制藥有限公司）；血紅蛋白稀釋液（都氏液，邁克科技）；生理鹽水（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1D07091609）；姬姆薩染液（上海江萊生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 72只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)字表分為6組，分別為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組（模型組）、玉屏風(fēng)散傳統(tǒng)飲片湯劑低、高劑量組和配方顆粒湯劑低、高劑量組，每組12只。

1.2.2 給藥及造模 動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行給藥，藥物劑量按人鼠體表面積折算等效比率劑量表［1］，計(jì)算出小鼠的等效劑量。傳統(tǒng)飲片湯劑低、高劑量組分別為每天5 g/kg、10 g/kg，配方顆粒湯劑低、高劑量組同傳統(tǒng)飲片湯劑組，正常對(duì)照組和模型組小鼠每天給予20 g/kg的生理鹽水溶液。各組均為每日灌胃1次，連續(xù)10 d。給藥前除正常對(duì)照組外，各組腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg復(fù)制免疫抑制模型，正常對(duì)照組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 對(duì)小鼠免疫器官的影響 各組于最后1次給藥后2 h將小鼠脫頸椎處死，取胸腺、脾臟稱重，并計(jì)算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)。

1.3.2 對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響 在末次給藥后小鼠腹腔注射5%可溶性淀粉2 mL，24 h后，每只小鼠取2%雞血紅細(xì)胞腹腔注射1 mL，間隔30 min后眼眶放血，頸椎脫臼處死，打開小鼠皮毛，腹腔注射Hank′s液0.5 mL，輕揉小鼠腹部1 min～2 min后，腹膜剪小口，無菌塑料吸管吸取腹腔液于載玻片上攤開，放濕盒內(nèi)，置37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min后取出，用生理鹽水沖洗，自然晾干后，用Giemsa-wright染色，再用生理鹽水淋洗，晾干后，油鏡下觀察，計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬百分率，即吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞占記數(shù)巨噬細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

1.3.3 對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞功能的影響 給藥第5天各組動(dòng)物腹腔注射5%綿羊紅細(xì)胞（SRBC）0.2 mL，免疫5 d后取脾，采用分光光度計(jì)法［2］測(cè)定脾抗體生成細(xì)胞功能（PFC），以O(shè)D值表示。

1.3.4 對(duì)小鼠血清溶血素形成的影響 眼球取血，靜置取血清，按1∶50稀釋，依次加入5%SRBC 0.5 mL、10%補(bǔ)體1 mL，37℃孵育30 min后離心取上清，加都氏試劑，分光光度計(jì)于540 nm波長(zhǎng)比色讀取OD值。另取5%SRBC 0.25 mL，加入都氏試劑，比色讀取OD值，即為實(shí)驗(yàn)中所用SRBC半數(shù)溶血時(shí)的OD值。血清溶血素含量以半數(shù)溶血值HC50表示，即樣品OD值與實(shí)驗(yàn)中所用SRBC半數(shù)溶血時(shí)OD值的比值再乘稀釋倍數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)。以 P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)小鼠免疫器官的影響

各組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的比較，結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的比較 （±s）

表1 各組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的比較 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 劑量（g/kg）脾指數(shù)（mg/10 g）胸腺指數(shù)（mg/10 g）正常對(duì)照組 12 - 40.5±2.32） 22.4±2.12）模型組 12 - 35.4±3.015.4±2.3玉屏風(fēng)散飲片組 24537.1±2.417.6±3.11039.6±2.21） 21.5±2.51）玉屏風(fēng)散顆粒組 24536.0±2.618.0±2.61038.4±3.51） 20.7±3.11）

由表1可見，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，玉屏風(fēng)散飲片、顆粒高劑量組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），玉屏風(fēng)散飲片、顆粒低劑量組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；玉屏風(fēng)散飲片高劑量組和顆粒高劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 對(duì)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響

結(jié)果見表2。

表2 對(duì)各組小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響 （±s）

表2 對(duì)各組小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05

組別 n 劑量（g/kg）吞噬率（%）正常對(duì)照組 12 - 65.5±15.31）模型組 12 - 45.4±13.0玉屏風(fēng)散飲片組 24550.1±10.41062.6±11.21）玉屏風(fēng)散顆粒組 24551.2±13.61061.4±13.51）

由表2可見，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠吞噬率顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，玉屏風(fēng)散飲片、顆粒高劑量組小鼠吞噬率均顯著升高（P＜0.05），玉屏風(fēng)散飲片、顆粒低劑量組吞噬率雖有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；玉屏風(fēng)散飲片高劑量組和顆粒高劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 對(duì)小鼠脾抗體生成細(xì)胞功能的影響

結(jié)果見表3。

表3 對(duì)各組小鼠脾抗體生成細(xì)胞功能的影響 （±s）

表3 對(duì)各組小鼠脾抗體生成細(xì)胞功能的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 劑量（g/kg）脾抗體生成細(xì)胞（OD）正常對(duì)照組 12 - 0.655±0.0832）模型組 12 - 0.345±0.032玉屏風(fēng)散飲片組 2450.461±0.023100.597±0.0761）玉屏風(fēng)散顆粒組 2450.485±0.036100.614±0.0651）

由表3可以看出，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠脾抗體生成細(xì)胞OD值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，玉屏風(fēng)散飲片、顆粒高劑量組小鼠脾抗體生成細(xì)胞OD值均顯著升高（P＜0.05），玉屏風(fēng)散飲片、顆粒低劑量組小鼠脾抗體生成細(xì)胞OD值升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；玉屏風(fēng)散飲片高劑量組和顆粒高劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 對(duì)小鼠血清溶血素的影響

結(jié)果見表4。

表4 對(duì)各組小鼠血清溶血素的影響 （±s）

表4 對(duì)各組小鼠血清溶血素的影響 （±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組別 n 劑量（g/kg）血清HC50正常對(duì)照組 12 - 212.43±22.452）模型組 12 - 129.34±18.32玉屏風(fēng)散飲片組 245145.47±17.2510201.59±20.761）玉屏風(fēng)散顆粒組 245150.45±17.6310210.14±19.651）

由表4可以看出，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清溶血素HC50顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，玉屏風(fēng)散飲片、顆粒高劑量組小鼠血清溶血素HC50均顯著升高（P＜0.05），玉屏風(fēng)散飲片、顆粒低劑量組小鼠血清溶血素HC50升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；玉屏風(fēng)散飲片高劑量組和顆粒高劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)是由各種具有免疫功能的細(xì)胞、產(chǎn)生免疫細(xì)胞的器官以及由這些細(xì)胞分泌的各種因子組成的一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)。脾臟是體內(nèi)最大的外周免疫器官，胸腺是重要的中樞免疫器官，二者的功能與機(jī)體免疫功能關(guān)系密切。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)執(zhí)行非特異性免疫作用的效應(yīng)細(xì)胞，同時(shí)在特異性免疫應(yīng)答的各個(gè)階段也起重要作用［3］。巨噬細(xì)胞的吞噬實(shí)驗(yàn)，是檢測(cè)機(jī)體非特異性免疫功能是否正常的一個(gè)重要方法，而巨噬細(xì)胞吞噬百分率是反映機(jī)體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一。主要參與體液免疫的B細(xì)胞功能缺陷或減低，可表現(xiàn)為細(xì)胞不能增殖，不能產(chǎn)生特異性抗體，抗體生成細(xì)胞數(shù)減少等，故抗體形成細(xì)胞和血清溶血素是代表機(jī)體體液免疫功能的可靠指標(biāo)。

玉屏風(fēng)散為中醫(yī)扶正固表的經(jīng)典方劑，實(shí)驗(yàn)研究提示該方對(duì)免疫系統(tǒng)有著較為廣泛的影響，在臨床上廣泛應(yīng)用［4］。為給中藥配方顆粒替代中藥飲片提供依據(jù)，本研究通過實(shí)驗(yàn)觀察玉屏風(fēng)散傳統(tǒng)飲片湯劑與配方顆粒湯劑對(duì)免疫抑制模型小鼠的免疫功能影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組較正常對(duì)照組小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能、脾抗體生成細(xì)胞功能、血清溶血素顯著降低，說明用環(huán)磷酰胺制備免疫功能低下模型成功。玉屏風(fēng)散傳統(tǒng)飲片高劑量和配方顆粒高劑量均能增強(qiáng)免疫抑制小鼠脾臟和胸腺功能，提高其腹腔吞噬細(xì)胞吞噬功能，加強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫作用，提高其脾抗體生成細(xì)胞功能，升高血清溶血素，促進(jìn)體液免疫。玉屏風(fēng)散傳統(tǒng)飲片高劑量和配方顆粒高劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明兩種湯劑等劑量間增強(qiáng)免疫功能作用基本相當(dāng)，為玉屏風(fēng)散配方顆粒在臨床上替代傳統(tǒng)飲片，進(jìn)一步推廣其應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］陳奇，王建華.中藥藥理研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：33.

［2］徐淑云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1436.

［3］任健，張倩落，鄭莉.人工蟲草多糖對(duì)免疫低下小鼠免疫功能的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（21）：1967-1969.

［4］張俐敏.風(fēng)藥用于治療慢性腎炎的研究［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，7（2）：24-26.