慢性高眼壓動物模型視網膜中睫狀神經生長因子及其受體的表達

范璐璐

睫狀神經營養因子（ciliaryneurotrophic factor receptor,CNTF）最初是從雞胚眼提取物中分離出的一種在能在體外促進雞胚睫狀神經元存活的蛋白質。最近有作者采用熒光金(Fluoro-gold) 標記RGCs的方法證實，在眾多因子中，CNTF是唯一能有效促進成年倉鼠RGCs再生的神經營養因子[1]。當視神經受損傷時，睫狀神經營養因子受體 alpha(ciliaryneurotrophic factor receptor alpha,CNTFRα)從細胞膜上釋放，以可溶形式與 CNTF共同反向運輸到受損部位，發揮其保護作用[2]。在發育成熟的視網膜中，CNTF主要在節細胞內表達，當視網膜受到機械或光損傷、缺血或視神經橫斷傷后，不僅節細胞內的 CNTF表達明顯增加，在視網膜各層也出現明顯的 CNTF表達[3]。本實驗利用兔慢性高眼壓模型，通過免疫組織化學檢測方法探討了兔慢性高眼壓損傷后視網膜中CNTF及CNTFRα的表達定位變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康新西蘭大白兔40只，體重2.5～3Kg，雌雄不限。采用電凝器電凝兔雙眼鞏膜表面至少三組靜脈以及角膜緣周圍血管建立慢性高眼壓模型,以眼壓升高＞22mmHg,并能持續1周為誘發慢性高眼壓成功[4]。選取造模成功的24只（48眼）兔慢性高眼壓眼，隨機分為4組慢性高眼壓模型組，每組6只兔（12眼），分別觀察7、14、21、28d。另取正常兔6只（12眼）只剪開其球結膜作為假手術對照組（簡稱對照組）。

1.2 慢性高眼壓動物模型的建立

速眠新 0.1ml/kg兔耳緣靜脈注射行全身麻醉，沿角膜緣剪開球結膜 270°,分離并暴露鞏膜表面靜脈,電凝器電凝雙眼鞏膜表面至少三組靜脈以及角膜緣周圍血管,高頻電凝功率為20～50mw,時間為5s，直至血管組織發白,血流阻斷。對照組只剪開球結膜，未進行鞏膜表面靜脈以及角膜緣周圍血管電凝。兔雙眼眼壓測量使用schiotz眼壓計,根據造模成功標準排除術后眼壓升高不理想個體。

1.3 組織取材與切片

動物到達存活時間點后，用速眠新注射液(0.3～0.8ml/kg)肌肉注射麻醉動物后，迅速摘除眼球，立即置于PFA液中固定(固定12小時后剪開角膜去除晶狀體和玻璃體繼續固定12小時)。取視乳頭正下方(6點位)1㎜處4㎜×6㎜大小的視網膜組織，用伊紅標記取好的視網膜組織的近視乳頭側。沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟定位包埋。將包埋好的視網膜標本沿近視乳頭側向遠視乳頭側連續切片，片厚4μm，每一標本切片5～8張。

1.4 免疫組織化學染色

本實驗采用免疫組織化學染色—辣根過氧化物酶–鏈酶卵白素（Streptavidin/Peroxidase，S-P）法，具體步驟如下：①切片常規脫蠟至水；②新鮮配制3%H2O2室溫下封閉30min；③抗原修復；④封閉液封閉，37℃孵育30min；⑤滴加適當比例稀釋的一抗（兔抗人CNTF多克隆抗體，兔抗人CNTFRα多克隆抗體），4℃冰箱內過夜，同種標本以PBS液代替一抗作陰性對照；⑥滴加生物素標記的二抗，37℃孵育 1h；⑦滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素(HRP—SP)，37℃孵育30min；⑧DAB顯色10min；⑨蘇木素復染；⑩梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

切片通過與電腦相連的 Biosens DigitalImaging systemV1.6高清晰度彩色病理圖文分析系統做細胞CNTF及CNTFRα蛋白表達的半定量分析。40×10倍顯微鏡下每張切片隨機選取 5個視野，以胞漿出現棕褐色顆粒為陽性判定標準，以平均積分光密度值(IOD)表示CNTF及CNTFRα表達的相對強度。

1.5 統計學分析

2 結果

CNTF及 CNTFRα的免疫組織化學染色結果（見圖1、2）。

圖2 不同時間點CNTFRα在兔視網膜組織的表達（SP×400）

在對照組中，CNTF與CNTFRα主要存在RGCs層，在其它各層CNTF與CNTFRα呈散在顆粒狀分布。慢性高眼壓損傷后，在視網膜的外核層、外網狀層、內核層、內網狀層和節細胞層CNTF及CNTFR α表達均顯著增加，并呈彌漫性分布。在造模后7、14、21d與對照組比較相差非常顯著(P＜0.01)，在造模后第7d，CNTF及CNTFRα表達最高，在造模后28d仍顯著高于對照組(P＜0.05)（見表1、2）。

表1 造模后對照組及慢性高眼壓模型各組兔視網膜CNTF及CNTFRα免疫組化染色圖象掃描的平均積光密度值

表2 對照組及模型組兔視網膜中CNTF及CNTFRα陽性表達變化趨勢

3 討論

青光眼是一種常見的致盲性眼病，其視神經損害的病理基礎是視網膜神經節細胞(Retinal ganglion cell，RGCs)及其神經纖維的喪失。多種視神經損傷模型的實驗研究均報道視神經損傷后視網膜中CNTF表達增強[5]。我們用免疫組織化學方法檢測的結果顯示，在對照組中RGCs層有大量的CNTF及CNTFR存在，在其它各層也存在散在顆粒狀分布的CNTF及 CNTFR。慢性高眼壓損傷后，CNTF及CNTFR在視網膜外核層、外網狀層、內核層、內網狀層和節細胞層表達顯著增加，并呈彌漫性分布，CNTF及CNTFR分布區域相同。Valter等[6]2003年9月報道用免疫組織化學方法和用高分辨率的共聚焦顯微鏡觀察發現在正常的和光損傷的大鼠視網膜中CNTFR主要分布在RGCs層，并且還發現在其它各層的 CNTFR呈顆粒狀散在分布，而且 CNTF與CNTFR共區域分布，本實驗中我們觀察到了同樣的結果。

有學者經研究認為光損害、視神經橫切導致了Müller細胞的活化，并伴隨CNTF分泌表達增加[7]。我們本次的實驗結果顯示慢性高眼壓損傷導致了視網膜自身CNTF和CNTFR的表達增加，最高表達均在造模后第7d，這可能是Müller細胞活化的結果。視網膜通過CNTF和CNTFR表達增強以減輕神經元的變性過程，抑或促進其再生和修復，這可能是節細胞一種自我保護機制。雖然以往的報道顯示CNTF能促進節細胞的存活和再生，但內源性的或外源性的 CNTF均未能最終防止節細胞的最終死亡。本實驗結果顯示慢性高眼壓損傷后雖然出現了 CNTF及CNTFR的表達增高，但這種增高都未能保持持續的上升，至 28d表達有所下降，這是否與微環境中存在神經生長抑制因子的表達有關？這些機制還有待進一步詳細的研究。

[1]Cui Qi, Lu Qiang,So KF, et al.CNTF, not other trophic factors,promotes axonal regeneration of axotomized retinal ganglion cells in adult Hamsters [J].Invest Ophthamol Vis Sci, 1999, 40: 760-766.

[2]Davis S,Aldrich TH, et al.LIFRa and gpl 30 as heterodimerizing signal transducer of the tripartite CNTF receptor[J].Science, 1993, 260:1805-1808.

[3]Sendtner M, Krontzberg GM,Thoenen H.Ciliary neurotrophic factor prevents the degeneration of motor neurons after axotomy[J].Nature, 1990,345:440-441.

[4]徐巖,陳祖基,宋潔貞.復方卡波姆誘發的兔高眼壓模型與其它兔高眼壓模型的比較研究[J].中華眼科雜志,2002,38(3):172-175.

[5]Honjo M,Tanibara H, Kido N,et al.Expression of ciliary neurotrophic factor activated by rtinal Müller cells in eyes with NMDA and kainic acid-induced neuronal death[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2000, 41:552-560.

[6]Valter K, Bisti S, Stone J.Location of CNTFRalpha on outer segments:evidence of the site of action of CNTF in rat retina[J].Brain Res.2003,985(2):169-75.

[7]Harada T,Harada C,Kohsaka S, et al.Microglia-Muller glia cell interactions control neurotrophic factor production during light-induced retinal degeneration[J].JNeurosci.2002,22(21):9228-36.