慢病毒介導的穩定沉默nm23-H1基因的肺癌細胞株的建立及生物學行為改變

羅猛 朱大興 弓磊 邱小明 祖玲玲 孫麗亞 吳志浩 周清華

腫瘤侵襲轉移是一個多基因調控、多階段、多步驟發生的復雜過程，也是導致腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。nm23-H1基因是第一個被發現的重要的腫瘤轉移抑制基因，它的結構和功能的異常與癌細胞的侵襲和轉移能力密切相關[1-5]。在前期工作中將化學合成的siRNA瞬時轉染低轉移的人大細胞肺癌細胞株NL9980以抑制nm23-H1基因的表達，研究發現NL9980細胞的侵襲力明顯增強[6]。但化學合成的siRNA介導的基因沉默只能維持較短的時間（5 d-7 d），為了更深入地研究nm23-H1基因沉默后對肺癌細胞侵襲轉移機制的影響，本研究利用慢病毒介導的shRNA技術，轉染人大細胞肺癌細胞株NL9980和肺腺癌細胞株A549，建立nm23-H1基因穩定沉默的細胞株，并觀察其體外侵襲力的改變，為進一步研究nm23-H1的功能、生化作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人大細胞肺癌細胞株NL9980由本實驗室建立。pcDNA3.1（+）表達載體為本實驗保存。A549肺腺癌細胞株購自美國ATCC。RPMI-1640、小牛血清購自美國Gibco公司。非靶標shRNA對照慢病毒顆粒（non-targeting shRNA, SHC002V）和特異性抑制nm23-H1基因的shRNA慢病毒顆粒（nm23-H1-shRNA；Clone ID：NM_000269.x-99s1c1、NM_000269.x-182s1c1和NM_000269.x-183s1c1）、嘌呤霉素和聚凝胺購自美國Sigma公司。克隆環購自美國Corning公司。M-MLV逆轉錄酶、dNTP mix、RNase抑制劑、隨機引物、DNA Marker購自TAKARA公司。總RNA提取試劑Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司。引物、Gold view核酸染料購自北京賽百盛公司。SYBR GREEN Master Mix、7500實時定量PCR系統購自美國ABI公司。nm23-H1鼠單抗（貨號：SC-56928）購自美國Santa Cruz公司，β-actin鼠單抗（貨號：A5441）購自美國Sigma公司。Boyden小室購自美國MiliPore公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA構建、慢病毒包裝 慢病毒載體為pLKO.1-puro，由U6啟動子引導shRNA的合成，并具有嘌呤霉素抗性篩選標記。將特異性靶向nm23-H1（NM_000269.2）mRNA不同序列（NM_000269.x-99s1c1：GCGTACCTTCATTGCGATCAA、NM_000269.x-182s1c1：TCCGCCTTGTTGGTCTGAAAT和NM_000269.x-183s1c1：CCGCCTTGTTGGTCTGAAATT）的21 bp反向互補發夾序列克隆入pLKO.1-puro載體，并包裝生產慢病毒，病毒滴度為106TU，購自Sigma公司。

1.2.2 細胞培養、慢病毒轉染和克隆細胞株篩選 轉染前1天將2×105個NL9980和A549細胞鋪板（6孔板），第2天細胞融合度為50%-60%，每孔加入含終濃度為8μg/mL的聚凝胺和慢病毒50 μL轉染。轉染24 h后加入嘌呤霉素1 μg/mL（選擇濃度由殺菌曲線確定）。每隔2 d-3 d觀察細胞情況，更換選擇培養基。2周左右開始有克隆生長。克隆環方法挑取單克隆細胞入24孔板，90%-100%融合度后轉入培養瓶擴增，鑒定，保種。

1.2.3 逆轉錄和定量PCR檢測nm23-H1基因表達 根據總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并進行逆轉錄PCR。逆轉錄nm23-H1引物：Forward：5′CAAGTGCTGCGAACCACG3′；Reverse：5′GACCAACAAGGCGGAATC3′，擴增長度為420 bp。參照基因GAPDH引物序列：Forward：5′ATGGGGAAGGTGAAGGTCG3′；Reverse：5′GGGGTCATTGATGGCAACAATA3′，擴增長度為108 bp。PCR擴增條件為：94oC、3 min，94oC、30 s，55oC、30 s，72oC、2 min，30個循環；72oC、5 min。取PCR產物10 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。nm23-H1定量PCR引物：Forward：5′AAAGGATTCCGCCTTGTTGGT3′；Reverse：5′GCCCTGAGTGCATGTATTTCAC3′，擴增長度為124 bp。定量PCR條件為：50 °C、2 min、1個循環；95°C、10 min、1個循環；95 °C、15 s，60 °C、1 min，40個循環。做熔解曲線檢測。2-ΔΔCT法計算基因表達差異[7]。

1.2.4 Western blot印跡檢測nm23-H1表達的變化 細胞裂解后提取總蛋白，BCA方法測細胞蛋白濃度后進行12%SDS-PAGE電泳。100 V轉膜1 h，抗nm23-H1和β-actin一抗4oC孵育過夜，洗膜后室溫二抗1 h。ECL顯影。

1.2.5 shRNA抵抗nm23-H1基因重組質粒轉染拯救實驗 根據shRNA（NM_000269.x-99s1c1:GCGTACCTTCATTGCGATCAA）序列設計nm23-H1基因shRNA抵抗序列，下劃線標記為突變堿基，該突變為沉默突變，不改變nm23-H1氨基酸編碼序列。突變引物：Forward：5′CGGATCCATGGCCAACTGTGA GCGAACATTTATCGCCATCAAACCA3′；Reverse: 5′GCTCTAGATCATTCATAGATCCAGTTCTGA3′。表達載體為pcDNA3.1（+）。PCR突變構建shRNA抵抗nm23-H1基因重組質粒。脂質體法將shRNA抵抗nm23-H1基因重組質粒3 μg轉染穩定沉默nm23-H1基因表達的肺癌細胞株NL9980-99和A549-99，48 h后收獲細胞做Western blot檢測。

1.2.6 侵襲小室實驗檢測侵襲力改變 每個上室加300 μL無血清的RPMI-1640進行ECM膠水化1.5 h，下室加500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640；然后將實驗組和對照組細胞接種于Transwell 6孔板的上室中，每孔接種細胞5×105，每組設3個平行孔。在細胞培養箱孵育48 h，對下室細胞消化后細胞計數，以穿過膜的細胞數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件分析系統處理結果，計量資料采用Mean±SD表示，應用t檢驗分析數據。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 nm23-H1基因穩定沉默細胞系mRNA和蛋白表達水平的檢測 人大細胞肺癌細胞株NL9980細胞用慢病毒介導的nm23-H1 shRNA轉染、篩選后，Western blot檢測3個shRNA （Clone ID: NM_000269.x-99s1c1,NM_000269.x-182s1c1和NM_000269.x-183s1c1）均獲得很好的nm23-H1基因沉默效果，以shRNA（NM_000269.x-99s1c1）最為明顯，而非靶向干擾序列則對nm23-H1的表達沒有抑制作用。故在A549肺癌細胞篩選實驗中只選用shRNA（NM_000269.x-99s1c1）病毒顆粒作轉染，并將nm23-H1基因穩定沉默的人大細胞肺癌細胞株NL9980和肺腺癌細胞株A549命名為NL9980-99和A549-99，將非靶標（non-target）對照細胞株命名為NL9980-non和A549-non。RT-PCR結果顯示與對照細胞株相比NL9980-99細胞nm23-H1基因含量明顯降低（圖1A），A549-99細胞株實時定量PCR結果顯示nm23-H1基因mRNA表達水平明顯降低（P=0.008,501）（圖1B），Western blot結果均證實nm23-H1蛋白表達明顯抑制（圖1C，圖1D）。

2.2 shRNA抵抗nm23-H1基因重組質粒轉染拯救實驗 將shRNA抵抗nm23-H1基因重組質粒轉染穩定沉默nm23-H1基因表達的肺癌細胞株NL9980-99和A549-99，48 h后收獲細胞做Western blot檢測，顯示恢復nm23-H1的正常表達（圖2A，圖2B）。

2.3 nm23-H1 基因表達抑制后侵襲力改變 Boyden小室實驗檢測發現nm23-H1基因穩定沉默后，NL9980-99細胞和A549-99細胞體外侵襲能力明顯增強，與對照組NL9980、NL9980-non和A549、A549-non細胞比較有統計學差異（P＜0.01），提示nm23-H1基因穩定沉默促進肺癌細胞的侵襲能力（圖3A，圖3B）。

3 討論

nm23基因是第一個被發現的腫瘤轉移抑制基因[1]。迄今為止，人類nm23基因已報道了8個亞型，即nm23-H1至nm23-H8，其中nm23-H1基因與腫瘤侵襲轉移的關系最密切，已得到人們的普遍重視[8]。nm23-H1具有二磷酸核苷激酶（nucleotide diphosphate kinase, NDPK）活性[9]、組氨酸蛋白激酶活性[10]和3’-5’核酸外切酶活性[11]。近期研究[12]顯示nm23-H1參與了紫外線誘導的DNA損傷修復過程，并可能與紫外線誘發的黑色素瘤的形成有關。Conery等[13]報道nm23-H1表達的缺失可以導致細胞染色體不穩定，從而參與腫瘤的形成過程。盡管20多年來國內外做了大量的研究，nm23-H1基因抑制腫瘤侵襲轉移的分子機制還未完全闡明。

我們的前期研究[14-16]顯示nm23-H1基因的低表達和雜合性缺失與人肺癌的高轉移性有密切關系。將野生型nm23-H1基因轉染人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981可以逆轉L9981的侵襲、轉移表型[17]。將化學合成的siRNA瞬時轉染低轉移的人大細胞肺癌細胞株NL9980抑制nm23-H1基因的表達，NL9980細胞的侵襲力明顯增強；通過基因芯片檢測發現基因表達譜發生明顯變化，表達上調的基因有707個，下調的有373個。其中上調基因主要有腫瘤轉移相關基因、細胞增殖、細胞周期、生長發育（包括胚胎發育和神經系統發育）以及細胞運動遷徙相關基因；下調基因包括腫瘤抑制基因、細胞骨架相關基因等[6]。上述研究結果說明nm23-H1基因可能是腫瘤侵襲轉移的上游調控基因，但nm23-H1基因調控的關鍵下游分子或靶點尚需進一步研究確定。

圖1 RT-PCR、定量PCR及Western blot檢測結果。A：RT-PCR檢測nm23-H1 mRNA在NL9980-99細胞中的表達，相對內參為GAPDH，與對照相比nm23-H1含量明顯降低；1：NL9980；2：NL9980-99；B：qRT-PCR檢測nm23-H1 mRNA在A549-99細胞中的表達，相對內參為GAPDH（P＜0.01）；C：Western blot檢測nm23-H1蛋白在 NL9980-99細胞中的表達，與對照相比表達量明顯降低；D：Western blot檢測nm23-H1蛋白在A549-99細胞中的表達，與對照相比表達量明顯降低。Fig 1 Results of RT-PCR, qRT-PCR and Western blot.A: The results of nm23-H1 mRNA RT-PCR, nm23-H1 expression greatly reduced compared with GAPDH;M: DNA marker; 1: NL9980; 2: NL9980-99; B: The results of nm23-H1 mRNA qRT-PCR, analysis of expression normalized with GAPDH (P＜0.01); C: The results of nm23-H1 expression in NL9980-99 cells by Western blot, nm23-H1 expression greatly reduced compared with β-actin; D: The results of nm23-H1 expression in A549-99 cells by Western blot,nm23-H1 expression greatly reduced compared with β-actin.

圖2 NL9980-99和A549-99細胞shRNA抵抗nm23-H1基因重組質粒轉染拯救實驗。A：NL9980-99細胞nm23-H1基因shRNA抵抗拯救實驗，與對照組相比nm23-H1基因重組質粒轉染組重現nm23-H1的正常表達；B：A549-99細胞nm23-H1基因shRNA抵抗拯救實驗，與對照組相比nm23-H1基因重組質粒轉染組重現nm23-H1的正常表達。Fig 2 shRNA rescue experiments in NL9980-99 and A549-99 cells. NL9980-99 and A549-99 cells were transfected with vector containing shRNA-resistant nm23-H1 cDNA to rescue the expression of nm23-H1. A: shRNA rescue experiments in NL9980-99 cells analyzed by Western blot; B: shRNA rescue experiments in A549-99 cells analyzed by Western blot.

圖3 Boyden小室檢測NL9980-99和A549-99細胞侵襲力的改變。A：NL9980-99細胞與對照相比，侵襲力明顯增強（P＜0.01）；B：A549-99細胞與對照相比，侵襲力明顯增強（P＜0.01）。Fig 3 Boyden chamber assay of NL9980-99 and A549-99 cells. A: Boyden chamber assay of NL9980-99 cells, compared with the control (P＜0.01); B:Boyden chamber assay of A549-99 cells, compared with the control (P＜0.01).

為了進一步研究這些功能改變及相關的分子機制，需要建立穩定沉默nm23-H1基因的肺癌細胞株。RNA干擾技術現已成為研究基因功能的重要工具[18]，但化學合成的siRNA介導的基因沉默只能維持較短的時間（5 d-7 d），而且通常轉染的效率較低[19]。因此，通過載體介導的RNA干擾就成為了選擇。近年來，由于慢病毒技術的發展及其自身的優點，如免疫原性低、感染范圍廣，可以高效整合到宿主細胞基因組穩定產生siRNA，使得慢病毒介導的RNA干擾成為穩定基因沉默的最常用選擇，并可克服化學合成siRNA的缺點[20]。

本研究通過慢病毒介導的特異性靶向nm23-H1基因shRNA，轉染人大細胞肺癌細胞株NL9980和肺腺癌細胞株A549，經過嘌呤霉素篩選獲得了穩定沉默nm23-H1基因表達的肺癌細胞株NL9980-99和A549-99。mRNA和蛋白水平檢測均證實nm23-H1的表達明顯降低，并通過轉染shRNA抵抗的nm23-H1表達載體，恢復nm23-H1的表達。該拯救實驗證實我們所建立的NL9980-99和A549-99細胞中nm23-H1基因沉默是由于RNA干擾機制降解了nm23-H1基因mRNA所致，而不是脫靶效應（offtarget effect）[19]。通過Boyden小室實驗觀察到nm23-H1基因沉默后，人大細胞肺癌細胞株NL9980和人肺腺癌細胞株A549細胞的侵襲力明顯增強，差異具有統計學意義（P＜0.01）。不同肺癌細胞株nm23-H1基因沉默后具有相似的侵襲力改變，逆向證明了nm23-H1基因腫瘤轉移抑制的功能。以上結果顯示本課題組成功建立了nm23-H1基因穩定沉默的人大細胞肺癌細胞株NL9980-99和肺腺癌細胞株A549-99，為更深入研究nm23-H1的功能、生化作用機制奠定了基礎。