穩定表達熒光素酶的nm23-H1表達缺失人肺腺癌細胞株的構建及其體內外活性檢測

王紅明 朱大興 吳志浩 周清華

癌癥極大地威脅著人類的健康，其中肺癌占據全球惡性腫瘤死亡原因的首位[1]。肺腺癌是肺癌的重要組織學類型，其惡性程度很高，極易出現浸潤和轉移。肺癌晚期的主要表現是發生轉移，它是肺癌的惡性標志和特征，也是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因，nm23-H1基因的低表達就是肺癌細胞轉移的重要原因之一[2,3]。近年來，隨著活體生物發光技術被廣泛應用于動物模型的研究，我們能夠通過活體生物成像系統直接監控生物體內的細胞活動和基因行為。特別是在各種類型的腫瘤研究中，能夠直接快速地測量各種腫瘤動物模型中腫瘤細胞的生長和轉移狀態，并可對治療中腫瘤細胞的變化進行實時觀測和評估。能夠無創傷地對動物整體的原位瘤、轉移瘤及自發瘤進行檢測及計量，即使微小的遷移也能被檢出[4-6]。

本實驗室先前已成功構建nm23-H1表達缺失的人肺腺癌細胞株A549/nm23-H1-shRNA。在此基礎上，本研究通過穩定轉染攜帶有螢火蟲熒光素酶（luc）基因的質粒進入該細胞株中，利用潮霉素B篩選出能穩定表達熒光素酶的細胞株A549/nm23-H1-shRNA-luc。借助活體成像技術，對構建的細胞株進行體內外生物發光檢測，為后續轉移相關的動物試驗的研究奠定好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 nm23-H1表達缺失的人肺腺癌細胞株A549（A549/nm23-H1-shRNA）由本實驗室構建；細胞培養基是RPMI-1640（GIBCO）并添加10%的小牛血清（NCS, GIBCO）；質粒表達載體（PGL4.50）購自Promega Corporation；質粒大提取盒購自Qiagen公司（Hispeed Plasmid Maxi Kit）；感受態細胞（Trans5α Chemically Competent Cell）購自北京全式金生物技術有限公司；轉染試劑為PolyJetTMIn Vitro DNA Transfection Reagent（SignaGen Laboratories）；篩選試劑為潮霉素B購自德國Merck公司；熒光素（Luciferin）購自Promega Corporation；實驗動物為裸鼠，雌性，4周齡，15 g左右，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。精諾真活體成像系統（購自美國公司，IVIS200）由本實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 質粒擴增與提取 按常用方法進行細菌轉化和質粒擴增。質粒提取過程參照Qiagen公司提供的大提取試劑盒說明書進行。所提取的質粒利用紫外分光光度計（Beckman DU800）進行純度和濃度的測定。

1.2.2 潮霉素最佳篩選濃度的測定 將處于對數生長期的nm23-H1表達缺失人肺腺癌細胞株A549/nm23-H1-shRNA用0.25%胰酶消化，以5×104個/孔接種于24孔板中，加入含10%NCS的RPMI-1640培養基于37oC、5%CO2的培養箱中培養過夜。鋪板第2天加入不同濃度的潮霉素（50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL、350 μg/mL、400 μg/mL、450 μg/mL、500 μg/mL、550 μg/mL、600 μg/mL），每3天換液1次，換液的同時加入以上不同濃度的潮霉素，共培養2周-3周。

1.2.3 細胞轉染

1.2.3.1 A549/nm23-H1-shRNA人肺腺癌細胞的培養 轉染前1天，用0.25%胰酶消化細胞，利用含10%NCS的RPMI-1640培養基將處于對數生長期的細胞制備成單細胞懸液，按3×105個/孔接種于6孔板中，每孔培養基為2 mL，置于37oC、5%CO2培養箱中培養，待細胞生長至鋪滿孔底80%左右后進行試驗。

1.2.3.2 PolyJetTM/DNA混合液的制備及轉染 轉染當天每個培養孔更換為無小牛血清的RPMI-1640培養基1 mL。取6 μg PGL4.50質粒與300 μL無血清含高糖的DMEM培養基輕輕混合均勻，標記為A管，再將18 μL PolyJetTM與300 μL無血清含高糖的DMEM培養基輕輕混合均勻，標記為B管，然后立即將B管中轉染試劑混合液加入A管中充分混合。室溫孵育15 min后將PolyJetTM/DNA懸液按100 μL/孔緩緩加入6孔板中，輕輕搖勻后置于37oC、5%CO2培養箱中繼續培養，5 h后，更換新鮮的含10%NCS的RPMI-1640培養基。

1.2.3.3 藥物篩選 轉染48 h后，棄去培養基，用PBS洗1遍。加入含有潮霉素的培養基進行篩選。每2-4天觀察細胞生長情況，并重新更換含有潮霉素的培養基。2周后，出現克隆。

1.2.3.4 篩選穩定的細胞株 挑選生長狀態良好的單克隆至96孔板中，用含潮霉素的培養基繼續培養，待細胞約90%-100%匯合后，轉移至48孔板繼續培養。同樣，當細胞生長至90%-100%左右時擴至24孔板中培養，再12孔板，6孔板，最后至90 mm的培養皿中培養。取部分細胞用0.25%的胰酶充分消化后，用PBS洗滌2遍，于IVIS系統成像觀察，挑選發光最強的1個克隆，分別凍存、繼續擴增培養。

1.2.3.5 A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞體外成像及其穩定性評估 將陽性單克隆細胞株用0.25%胰酶消化、計數，取1×104個細胞懸浮于100 μL培養基中，按1:2的比例逐孔稀釋，接種于黑色的96孔板中，使細胞數按2:1比例逐孔遞減，分別加入熒光素（150 μg/mL），另設2孔作為陰性對照。靜置3 min-4 min后，成像1 min。生物發光值按每秒光子量（photons/s）計算。繼續將A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞持續培養9周（共計40代），每隔8代利用活體成像技術檢測細胞生物發光情況一次，以觀察luc基因是否穩定表達。

1.2.3.6 A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞在活體內發光影像及其穩定性的檢測 每只裸鼠（共10只，雌性，每只約15 g）右后腹股溝處皮下注射0.1 mL的A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞懸液（濃度為4×107個/mL），然后給每只裸鼠腹腔內注射0.2 mL的熒光素（用1×PBS配置成15 mg/mL的熒光素，并過濾）。7 min-8 min后，將其放入麻醉箱內用氣體異氟烷麻醉，并成像1 s。觀察及測量結束后，斷頸處死裸鼠。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件及Excel 2003分析作圖，資料描述使用均值、標準差等指標。統計推斷運用方差分析、直線相關等方法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 潮霉素最佳篩選濃度的測定結果 按實驗設計加入不同濃度的潮霉素（50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL、350 μg/mL、400 μg/mL、450 μg/mL、500 μg/mL、550 μg/mL、600 μg/mL），培養5 d后，每孔均可見不同程度的細胞死亡，培養14 d后，潮霉素濃度為300 μg/mL、350 μg/mL及以上的組的細胞均死亡，并可見細胞骨架及碎片。其它組濃度的細胞雖也有不同程度的細胞死亡但未完全死亡。因此可以確定潮霉素對nm23-H1表達缺失的人肺腺癌細胞A549（A549/nm23-H1-shRNA）的最佳篩選濃度為300 μg/mL（圖1）。

圖1 濃度梯度實驗中，A549/nm23-H1-shRNA細胞在加不同濃度潮霉素14 d后顯微鏡下的變化（×40）。A：A549/nm23-H1-shRNA細胞在潮霉素濃度為250 μg/mL下14 d后的變化；B：A549/nm23-H1-shRNA細胞在潮霉素濃度為300 μg/mL下14 d后的變化；C：A549/nm23-H1-shRNA細胞在潮霉素濃度為350 μg/mL下14 d后的變化。Fig 1 Morphologic changes of A549/nm23-H1-shRNA cells under microscope which were added different doses of hygromycin B in 14 days in concentration gradient experiment (×40). A: The changes of A549/nm23-H1-shRNA cells under microscope which were added hygromycin B (250 μg/mL) in 14 days; B: The changes of A549/nm23-H1-shRNA cells under microscope which were added hygromycin B (300 μg/mL) in 14 days; C: The changes of A549/nm23-H1-shRNA cells under microscope which were added hygromycin B (350 μg/mL) in 14 days.

2.2 細胞轉染后陽性克隆的形成 A549/nm23-H1-shRNA細胞在80%匯合度時應用PolyJetTM轉染試劑轉染攜帶有luc基因的質粒PGL4.50。48 h后，加入潮霉素（300 μg/mL）。5 d后大部分細胞死亡，僅有少部分細胞存活，并形成克隆（14 d）。將形成的克隆繼續在含300 μg/mL潮霉素的培養基中篩選擴增（圖2）。

2.3 A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞體外成像鑒定 攜帶有luc基因的質粒經擴增和純化后可以有效轉染nm23-H1表達缺失的人肺腺癌A549細胞，在含有300 μg/mL潮霉素培養液中可篩選出高表達的陽性細胞株。由圖3可見，每孔最小可探測到的細胞數為39個。細胞發光值（y）對細胞數目（x）的回歸方程是：y=3,699.9x+992,237，R2=0.975,1，顯示細胞數目與發光值呈直線相關（圖4），同時也證明了熒光素酶基因已經穩定轉入A549/nm23-H1-shRNA細胞中。

2.4 評估A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞表達熒光素酶的穩定性 每次檢測細胞生物發光值均設3個復孔，約隔周成像檢測，共5次。其結果為：（3.14±0.55）×107、（3.29±0.49）×107、（3.27±0.25）×107、（3.26±0.13）×107、（3.12±0.22）×107。各組相比差異無統計學意義（P＞0.05）（圖5）。這說明，隨著細胞傳代數的增加，細胞表達熒光素酶（luciferase）活性無明顯變化，仍能維持在穩定水平。

2.5 A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞在裸鼠體內成像的觀察及分析 A549/nm23-H1-shRNA-luc肺癌細胞株在裸鼠體內的熒光信號在接種后可以被檢測到。隨機把裸鼠種植瘤模型分成兩組（5只/組），分別命名為：Group 1和Group 2（圖6），所測得的生物發光值均在同一數量級（109）（圖7），兩組所測得的生物發光值差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 A549/nm23-H1-shRNA細胞轉染前后及加潮霉素篩選后顯微鏡下變化（×40）。A：A549/nm23-H1-shRNA細胞在80%匯合度時的細胞形態；B：A549/nm23-H1-shRNA細胞在轉染PGL4.50質粒48 h后的細胞形態；C：A549/nm23-H1-shRNA細胞在轉染后加潮霉素篩選5 d后僅存的細胞形態；D：A549/nm23-H1-shRNA細胞在轉染后加潮霉素篩選14 d后單克隆的細胞形態；E：A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞鋪滿孔底后的細胞形態。Fig 2 Morphologies of A549/nm23-H1-shRNA cells before and after being transfected with PGL4.50 and changes after being added hygromycin B (×40). A: The morphology of A549/nm23-H1-shRNA cells up to 80%; B: The morphology of A549/nm23-H1-shRNA cells after 48 h of being transfected with PGL4.50; C: The morphology of A549/nm23-H1-shRNA cells that survived after 5 days of being added hygromycin B; D: The morphology of the monoclonal cells after 14 days of being added hygromycin B; E: The morphology of A549/nm23-H1-shRNA-luc cells up to 100%.

圖3 A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞活體外成像圖示，最小可檢測到的細胞數目為39個。Fig 3 In vitro bioluminescence imaging of A549/nm23-H1-shRNA-luc cells, 39 cells are detectable at least.

圖4 細胞數目和發光值呈明顯的直線相關性（R2=0.975,1,P＜0.001）Fig 4 An apparent correlation between the number of cells and bioluminescence values is well analyzed(R2=0.975,1, P＜0.001)

圖5 A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞活體外生物發光值的穩定性評估示意圖（P＞0.05）Fig 5 The bar chart to evaluate the stability of bioluminescence values of A549/nm23-H1-shRNA-luc cells in vitro (P＞0.05)

3 討論

隨著對腫瘤分子生物學研究的深入，對基因、蛋白質功能的探索，我們最終研究的方向是在生物的活體環境中進行[7-11]。但傳統的動物實驗方法需要在不同時間點宰殺實驗動物以獲得數據，得到多個時間點的實驗結果，其局限性主要表現為動物需求量大、實驗過程中人為操作差異性大、實驗過程耗時、獲取信息量少等。近年來，隨著微型非侵入性成像技術的發展，在實驗動物環境中追蹤腫瘤的發生發展成為可能[12]。相比之下，體內可見光成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，由于能夠對同一動物進行連續檢測，在最大程度上減少了不同實驗動物之間的個體差異以及傳統檢測方法的誤差所造成的對實驗結果的影響[13]。動物活體體內光學成像主要有生物發光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術。生物發光技術是應用熒光素酶基因標記細胞或DNA，而熒光技術則采用熒光報告基團進行標記，然后利用靈敏的光學儀器直接檢測活體生物體內的細胞活動和基因行為。生物發光技術相對于熒光技術而言，其具有檢測的靈敏度高、特異性強、發光背景低、并能檢測深部腫瘤等特點[14]，生物活體發光技術已成為當今體內研究的熱點，其原理是在小的哺乳動物體內利用報告基因—熒光素酶基因表達所產生的熒光素酶蛋白（luciferase）與其小分子底物熒光素（luciferin）在氧，Mg2+存在的條件下消耗ATP發生氧化反應，將部分化學能轉變為可見光能釋放。因此只有在活細胞內才會產生發光現象，并且光的強度與標記細胞的數目線性相關。在體外利用敏感的CCD相機設備定量檢測體內所發射的光子數量并將之轉換成圖像。它可以快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測評估；可以無創傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤等[15]。其中，采用熒光素酶基因標記腫瘤細胞，使腫瘤細胞成為發光源，是后續建立移植瘤動物模型的基礎。經過標記后的腫瘤細胞能夠穩定表達熒光素酶，其發光強度和細胞的數量具有非常好的線性關系[16]。現行建立熒光素酶動物模型所使用的報告基因多為luc+型熒光素酶基因，本文中使用的是PGL4.50質粒載體攜帶有新一代luc2型高靈敏熒光素酶報告基因，其熒光素酶表達水平較普遍使用的luc+型有很大提高，催化底物熒光素發生氧化反應的效率更高，生物發光信號更強，因此對肺腺癌移植瘤動物模型中腫瘤細胞的檢測更加靈敏。

圖6 裸鼠種植A549/nm23-H1-shRNA-luc腫瘤細胞后活體成像圖示Fig 6 In vivo imaging of two groups of nude mice after A549/nm23-H1-shRNA-luc cells were implanted into nude mice

圖7 裸鼠種植A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞后活體成像所測得的生物發光值Fig 7 The bar chart of bioluminescence values in vivo after A549/nm23-H1-shRNA-luc cells were implanted into nude mice

結合本實驗室的研究方向，我們希望構建出一個高轉移肺癌移植瘤模型。本研究通過對nm23-H1表達缺失的人肺腺癌細胞株A549/nm23-H1-shRNA進行luc基因標記，構建出能在免疫缺陷的裸鼠體內生長、轉移，并能穩定表達熒光素酶的細胞株A549/nm23-H1-shRNA-luc。本研究體外生物發光檢測結果顯示所篩選的穩定細胞株A549/nm23-H1-shRNA-luc的細胞數和其生物發光強度呈明顯的線性相關，最小可探測到的細胞數為39個，且多次、間斷的細胞體外活體成像數據顯示，隨著傳代和時間的變化，該細胞株的生物發光值無明顯改變（P＞0.05）（圖5）。體內生物發光結果顯示，兩組相同細胞在裸鼠體內所測得的生物發光值的差異無統計學意義（P＞0.05）（圖7）。以上體內外實驗結果無一不證實了我們所構建的A549/nm23-H1-shRNA-luc細胞株是能夠在非選擇條件下穩定、長期地表達熒光素酶的細胞株。這種由活體成像技術所提供的數據，為以后判斷腫瘤生長的大小提供了量化指標，從而為直接用生物發光強度判斷腫瘤細胞在裸鼠體內生長和轉移提供了依據。

下一步筆者將對建立好的nm23-H1表達缺失的肺腺癌移植瘤動物模型進行相關基因靶向治療的研究。通過生物活體成像技術可以對治療后動物體內腫瘤細胞進展變化進行量化以判斷治療效果[17-20]，這為基因治療的研究及發展提供新的方向。