肺癌中EML4-ALK融合基因的存在狀態及生物學功能

楊統 綜述 劉紅雨 陳軍 審校

肺癌是當前世界上最常見的惡性腫瘤，主要包括小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩類，而NSCLC約占肺癌總數的80%。盡管外科手術技術不斷提高，化療新藥不斷上市并進入臨床應用，但肺癌患者的預后仍然很差，原因是大多數NSCLC患者確診時已處于晚期，失去了手術治療的機會。同時部分臨床診斷為早期的肺癌患者，手術后發生復發轉移。長期以來，化療在晚期NSCLC的治療中占據主要地位，1995年進行的meta分析顯示，以鉑類為基礎的化療相對于支持治療可以提高患者存活率[1]。20世紀90年代，第三代化療藥物有了較大進展，多西紫杉醇、紫杉醇、長春瑞濱、吉西他濱等藥物應用于肺癌患者。然而，以鉑類為基礎的化療方案在晚期（IIIb或IV）NSCLC患者中，緩解率（response rate,RR）為30%-40%，中位生存期僅為8個月-10個月[2]。如何更好而有效地改善NSCLC患者的生存率和生存時間，提高治療效果，成為臨床和科研工作者的一個研究方向和目標。

近年來，隨著分子生物學技術的發展，產生了一些針對細胞特定分子的分子靶向治療藥物，這些藥物針對性強，能特異性地殺傷腫瘤細胞。其中，針對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinases inhibitors, EGFR-TKI）的分子靶向治療受到了極大的關注。目前，有兩種EGFR-TKI（厄洛替尼和吉非替尼）成功在中國上市，其藥物特點是口服、高效、高特異性，病人耐受性好，無骨髓抑制和神經毒性，能明顯延長敏感患者生存期[3]，改善患者生活質量。但是，相關的臨床研究[4,5]結果顯示吉非替尼對東方人NSCLC的有效率為25%-35%，對西方人的有效率僅為8%-15%，臨床研究表明腺癌、女性、非吸煙、亞裔的NSCLC患者獲益明顯。

2010年，日本學者[6]研究了具有EGFR 19外顯子缺失突變和21外顯子L858點突變的病例，比較單純使用吉非替尼組與單純使用順鉑加紫杉醇組的生存時間后發現，在具有突變的患者中，使用吉非替尼者的生存時間較單純使用化療藥長（9.2個月 vs 6.3個月），而在不具有EGFR外顯子突變的非吸煙腺癌患者中，單純使用吉非替尼者的生存時間也較單純使用鉑類化療藥物的時間延長。因此，在亞洲的非吸煙腺癌患者中，使用EGFR-TKI靶向藥物吉非替尼的療效優于傳統的化療，這無疑是肺癌治療史上的一個巨大的進步。

然而，2007年，日本學者在腺癌患者中發現了一個亞群，這部分患者具有人類棘皮動物微管相關蛋白樣4（echinoderm microtubule-associated- protein-like 4, EML4）和人類間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）重排形成的融合基因，即EML4-ALK融合基因，對EGFRTKI治療和傳統的化療不敏感，而可能對ALK抑制劑敏感[7]。后來的研究發現，具有EML4-ALK重排的患者有其獨特的臨床病理生理特征，提示其治療有別于一般的腺癌，本文就EML4-ALK融合基因的發現及研究現狀作一綜述。

圖1 EML4-ALK融合基因形成示意圖Fig 1 Schematic representation of fusion junctions and flanking sequences of the EML4-ALK fusion gene. Fusion of the N-terminal portion of EML4 (comprising the basic region, the HELP domain and part of the WD-repeat region) to the intracellular region of ALK(containing the tyrosine kinase domain).

1 EML4-ALK融合基因的發現

2007年日本學者Soda等[7]在一名62歲男性吸煙肺腺癌患者手術標本中擴增出一個由3,926個堿基組成的cDNA片段，編碼一個由1,059個氨基酸組成的蛋白質，該蛋白的氨基端（殘基1-496）是EML4編碼蛋白的一部分，而羧基端（殘基497-1,059）則由ALK編碼蛋白的一部分構成，提示這個cDNA片段由是EML4和ALK的融合形成。此病例的EGFR和KRAS基因均為野生型。如圖1所示，該融合基因定位于2號染色體的短臂上（2p21和2p23），其5'端為EML4的片段，3'端為ALK的片段，由倒置后的EML4基因片段與殘余的ALK片段連接。該融合基因擁有EML4基因中的basic區域、疏水的棘皮動物微管相關蛋白區（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein, HELP）以及部分WD重復區（后兩部分在部分亞型中缺失）和ALK基因中的Kinase功能區；此外在75個病例中發現了另外5例也具有EML4-ALK融合基因，因此，提示具有EML4-ALK融合基因的患者可能為NSCLC的一個特殊群體。

目前，已至少發現了14種EML4-ALK的變異體。這些變異體均有功能，均為EML4的不同外顯子與ALK的20外顯子相融合。變種1（V1），為EML4的第13外顯子與ALK的第20外顯子相連；變種2（V2），為EML4的第20外顯子與ALK的第20外顯子相連[7]；變種3（V3），有兩個亞變種（V3a/b），V3a為EML4的第6外顯子與ALK的第20外顯子相連，而V3b為EML4的第6外顯子加上一個33 bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連[8]；變種4（V4），為EML4的第14外顯子加上一個11 bp的小片段再與前面缺失49 bp的ALK的第20外顯子相連；變種5（V5），有兩個亞變種（V5a/b），V5a為EML4的第2外顯子與ALK的第20外顯子相連，而V3b為EML4的第2外顯子加上一個117 bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連[9]；變種6（V6），為EML4的第13外顯子加上一個49 bp的小片段再與ALK的第20外顯子相連；變種7（V7），為EML4的第14外顯子與前面缺失12 bp的ALK的第20外顯子相連；變種8（“V4”），為EML4的第15外顯子缺失了后面19 bp再與前面缺失20 bp的ALK的第20外顯子相連；變種9（“V5”），為EML4的第18外顯子與ALK的第20外顯子相連[10]。

2 EML4-ALK融合基因陽性患者的病理生理學特征

幾乎所有研究均顯示EML4-ALK融合基因主要存在于NSCLC中，其出現頻率為5%-10%。研究顯示EML4-ALK融合基因陽性患者多為不吸煙或少吸煙的腺癌患者，多伴隨印戒細胞樣改變，與EGFR突變相比，EML4-ALK融合基因多出現于男性，較EGFR突變者年輕，在亞洲人群中出現的比例較大；與EGFR突變和KRAS突變多不會同時出現，即具有EML4-ALK融合基因的患者多為EGFR和KRAS野生型，而EGFR和/或KRAS突變的患者多不具有EML4-ALK融合基因[11,12]。EGFR-ALK患者對EGFRTKI治療不敏感，表現為對TKI治療的原發性耐藥；比較EML4-ALK陽性組與陰性組后發現兩組患者對鉑類藥物的治療效果無明顯差異，總的生存時間也無統計學差異[13]。

3 EML4-ALK融合基因可能的生物學功能

EML4-ALK融合基因的發現者Soda等將攜帶EML4-ALK基因的質粒轉染小鼠胚胎成纖維細胞3T3，而使后者獲得了致瘤性，接種于裸鼠皮下后成瘤。而在攜帶EML4-ALK的所有轉基因小鼠的肺組織中，自發性形成數百個腺癌病灶。這種轉基因的小鼠在口服ALK激酶的抑制劑后，腫瘤均趨于消失；而在靜脈注射轉染EML4-ALK的3T3細胞后，小鼠均由于呼吸衰竭而死亡，而使用ALK激酶抑制劑后，能明顯延長這些小鼠的生存時間。使用特異的siRNA沉默EML4-ALK融合基因后，能抑制相關腫瘤細胞的生長[14]。這些均提示EML4-ALK基因在肺癌的形成過程中起著重要的作用。

研究者研究了EML4-ALK融合基因的各個功能區，其中，EML4基因片段中的basic區及ALK基因的kinase區在各個亞型中均包含。后者為ALK基因的膜內催化區域，其激活后通過相關信號通路與細胞增殖、存活、遷移密切相關。EML4基因片段扮演著能使該融合基因產物蛋白二聚化的功能，因為ALK基因的膜內催化區域能在形成二聚體時激活，其異常激活導致細胞的癌變。Soda等[7]構建缺失EML4 Basic區、HELP區、WD區質粒的3T3細胞，接種裸鼠后發現缺失EML4 Basic區完全不能成瘤，而缺失HELP區和WD區均能成瘤，但瘤體較小，提示各功能區在肺癌的轉化過程中均發揮作用，但Basic區的作用可能最為重要。

對于EML4-ALK融合基因信號通路的研究，與其它ALK基因重排的融合基因一樣，都是對ALK基因信號通路的研究，都是通過激活ALK基因的膜內催化區域達到細胞癌變的效果。目前研究發現其與STAT3、AKT/PI3K及RAS/ERK三條信號通路有關系。轉錄因子C/EBPβ（CCAAT/enhancer binding protein beta）具有提高細胞增殖和生存的能力。ALK基因通過STAT3信號通路提高C/EBPβ的mRNA及蛋白水平，還通過ERK1/2磷酸化C/EBPβ的第235位蘇氨酸激活C/EBPβ蛋白[15]。研究[16]發現ALK也可以通過SHH/GLI1信號通路發揮作用，且可激活AKT/PI3K信號通路穩定GLI1蛋白。

4 EML4-ALK融合基因的檢測方法

自從該融合基因發現以來，為尋找更簡便和更準確的方法，研究人員做了各方面大量的研究。目前最常用的方法是反轉錄PCR（RT-PCR）。RT-PCR是一種很靈敏的技術，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。利用手術切除標本或其他標本，提取總RNA后進行RT-PCR，對PCR產物進行電泳以確定是否含有EML4-ALK融合基因。通過對各種不同亞型進行專門引物的設計，可以分辨出各種不同亞型的EML4-ALK融合基因。

熒光原位雜交技術（fluorescent in situ hybridization,FISH）也是常用的方法。 FISH是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態和分布，或者是結合了熒光探針的DNA區域或RNA分子在染色體或其它細胞器中的定位。通過對EML4基因及ALK基因進行熒光標記，在熒光顯微鏡下查看這兩種基因的位置關系判斷是否有染色體易位，以確定是否有EML4-ALK融合基因[17]。

Western blot的方法也是檢測EML4-ALK融合基因的方法之一。Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。Western blot主要用來確定EML4-ALK融合基因是否表達及表達情況。

除了以上幾種常用的方法外，還有其它各種常規或新的方法。Zhang等[18]使用了一種RACE-coupled PCR的方法，也很好地檢測出了EML4-ALK融合基因陽性的樣本。Takeuchi等[19]發現了一種新的檢測ALK相關融合基因的免疫組化方法-iAEP（antibody-enhanced polymer）。該法將ALK蛋白的不同區域分別做出相應的特異性抗體，然后用這些抗體特異檢測標本中ALK蛋白不同區域的表達情況。若5'端的區域與3'端的區域表達差異較大，則說明有ALK融合基因。表1列出了文獻[7,9,11,13,14,18-25]報道的檢測EML4-ALK的方法及陽性率。

表1 文獻所用檢測EML4-ALK的方法及陽性率Tab 1 EML4-ALK fusion gene previously reported by the literatures in lung cancer

5 展望

目前在NSCLC中EML4-ALK融合基因的亞型已經有14種。Lin等[14]發現一種EML4的21外顯子與ALK的20外顯子融合而成的新亞型，但僅在大腸癌中出現，并未在肺癌中檢測到，或許更敏感的檢測方法或更大樣本量的檢測能發現更多新的亞型。

現在對EML4-ALK融合基因在信號轉導通路方面的研究還剛開始，相信這部分的研究將是以后的重點。如果信號通路明確的話，可以設計相應的藥物，這將對治療有極大的幫助。實驗中通過對EML4-ALK融合基因陽性的細胞系及EML4-ALK融合基因陽性的小鼠進行一些嘗試性的治療，觀察細胞系的生長情況及小鼠腫瘤的生長情況，發現其對吉非替尼耐藥，對鉑類藥物低反應，但ALK抑制劑對其有效，能明顯抑制腫瘤的生長[13,26]。

由于目前在臨床上相關特征并無超大樣本的統計資料，對一些特征還是比較難以把握，并且一些更常規高效的檢測方法有待研究，EML4-ALK融合基因檢測真正應用于臨床還有一定的距離。

綜上所述，EML4-ALK融合基因存在于NSCLC中，很有可能成為在EGFR突變與KRAS突變之外的另一個重要的分子靶點，進一步研究可能會展現出與NSCLC的發生、發展、治療及評估等方面相關的新領域。