一株萘降解菌的篩選及其降解途徑

王 博，劉兆普，隆小華，姚 瑤，黃玉玲

南京農業大學江蘇省海洋生物學重點實驗室，南京 210095

多環芳烴(PAHs)在環境中分布廣泛，是一類化學結構復雜，具有誘變性和致癌性的污染物，它可通過生物鏈的傳遞進行富集，對環境和人類造成極大的危害。微生物在PAHs的降解過程中起著重要作用，因此，PAHs的生物降解途徑成為國內外的研究熱點［1］。篩選對PAHs有較強耐受性和降解性的菌株和菌系，對于污染的治理具有重要的意義。

萘(naphthalene)是PAHs的代表性化合物，為無色片狀晶體，熔點80.5℃，沸點218℃，不溶于水，但易于溶于熱的乙醇和乙醚，具揮發性。萘廣泛存在于油田污染的土壤和水體中，對周圍的生態環境和人類健康危害極大，已被美國環保署(EPA)確定為重點污染物，也是我國嚴格控制的一類污染物［2］。不同于物理和化學方法，萘的微生物治理方法優勢明顯，低成本，效果佳，無污染，具有顯著的經濟效益和生態效應［3］。

國內外做了大量的工作不斷豐富萘降解菌種，篩選培育高萘降解率菌株，一些菌株的萘降解率可以達到 99.6% 以上［4］。宋昊等［5］研究了一株帕氏氫噬胞菌的萘降解特性，在萘質量濃度為39.8 mg/L時，培養96 h，其萘降解率可達98%，但其底物濃度耐受低，對溫度變化敏感，28℃為生長最適溫度。蔡寶立等［6］發現的一株假單胞菌，能耐受萘質量濃度為2 g/L，但菌株在pH 6.0下生長受到抑制，此外該菌還能利用一些芳香族化合物為唯一碳源。李文等［7］在濱海濕地紅樹林中篩選出了4株萘降解菌，萘濃度為100 mg/L的無機鹽培養基中培養5 d，萘降解率最高為54.2%。目前為止，已發現的具有萘降解能力的菌種遍布假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、微球菌(Micrococcus)、產堿菌(Alcaligenes)、棒狀桿菌(Corynebacteria)以及真菌和藻類等。萘的生物降解途徑主要分兩種，一種為鄰苯二酚途徑，萘在編碼酶的作用下生成水楊酸，而后轉化為鄰苯二酚，經間位或者鄰位裂解開環，降解為一系列可進入三羧酸循環的小分子物質，其代表菌株為Pseudomonas［8］。另一條途徑為龍膽酸途徑，萘氧化為水楊酸后，在水楊酸5-羥化酶的作用下，生成龍膽酸，經過一系列的氧化進行降解［9］。本研究從濱海鹽堿地受石油污染的土壤中分離到一株萘降解菌W1，經過生理生化以及分子鑒定為沙雷氏菌屬，研究了該菌萘降解特性和底物利用的特性，分析了該菌萘降解過程的中間產物，探討了其可能的萘降解途徑，為濱海鹽堿土壤中萘以及多環芳烴的污染治理提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

石油污染土樣采集于勝利油田;萘，環己烷(Cyclohexane，純度大于99.5%)購于國藥集團化學試劑有限公司;透射電鏡型號為日立H-7650(工作電壓80 kV)。

1.2 主要培養基

無機鹽培養基:NH4NO310 g，KH2PO41.5 g，K2HPO43.0 g，加入微量元素液 2 mL，水 1 L，pH 7.5，固體加2%瓊脂。

微量元素液:MgSO44 g，CuSO41 g，MnSO41 g，FeSO41 g，CaCl21 g，水 1 L。

萘溶液:5 g萘溶于1 L正己烷，配成5 mg/mL的濃縮液，常溫避光保存。

固體含萘培養基:無機鹽培養基，加入0.2%微量元素液，1%萘溶液。

菌株馴化培養基:1 L 50 mg/L含萘培養基加入0.05 g酵母膏。

1.3 萘降解菌的篩選與分離

稱取10 g的石油污染土樣加入到90 mL無菌水中，200 rpm，28℃振蕩培養1 h后，靜置30 min，吸取10 mL上清液于菌株馴化培養基，在200 rpm，28℃條件下搖床培養5 d。待培養液混濁后，吸取5 mL培養液重新轉接入新鮮的與上述相同的菌株馴化培養基中，培養條件保持不變，連續轉接馴化培養5次。將第5次搖床培養得到的菌液系列稀釋后，取0.1 mL涂布于固體含萘培養基，28℃培養2 d，連續轉接培養3次，挑出單菌落，得到能夠以萘為唯一碳源的菌株。

1.4 萘降解率的測定［10］

在100 mL含萘水樣中接種N7菌液，另設不接菌100 mL含萘水樣作為空白對照，經搖床振蕩培養3 d后，加入20 mL正己烷萃取，轉至分液漏斗，振蕩1 min，靜置，待分層后分離，收集上層液，再用10 mL正己烷萃取2次下層液體，合并上層液用干燥的無水Na2SO4脫水，45℃旋轉蒸發，N2吹干后，用甲醇定容至1 mL，待測。以同步不加菌液搖床振蕩的含萘水樣為空白對照。Agilent 1100 Series HPLC分析條件:分離柱為 ZORBAX SB-Aq(5 μm，250 mm×416 mm);柱溫27 ℃，流速 0.18 mL/min，流動相為乙腈/水=50/50;檢測波長218 nm。

降解率的計算公式為:

式中，m1為對照組的萘殘余質量(mg)，m2為樣品的萘殘余質量(mg)。

1.5 菌種的鑒定

1.5.1 生理生化鑒定

對篩選出的細菌進行形態學觀察和生理生化實驗鑒定［11］，初步鑒定到屬。

1.5.2 降解菌株的16S rDNA的鑒定

細菌總DNA的提取方法及PCR操作參考文獻［12］。

以總DNA為模板，用16S rDNA的專一性引物F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 R:5’-GGT TACCTTGTTACGACTT-3’，目的片段大小為1500 bp左右。用TaqDNA聚合酶進行PCR擴增。PCR產物經克隆至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH5α菌株，DNA測序。

將測得的16S rDNA序列在GenBank中BLAST查找相似的核苷酸序列，用DNAMAN(version 4.0，Lynnon Biosoft)軟件進行比對，來推測鑒定菌株。

1.5.3 生長曲線測定

用濁度法測定W1菌株的生長曲線［13］。將W1菌株分別接種于LB培養基和以萘為唯一碳源的無機鹽培養基中，分別每隔2 h和6 h，取接菌和不接菌培養基測定其OD600值，繪制生長曲線。

1.6 菌株降解特性分析

將菌種接種于100 mL萘質量濃度為100 mg/L的無機鹽培養基中，每次確定一個因素為變量(底物濃度、pH值、鹽度、溫度)，其他因素不變，并設空白對照組，搖床培養3 d測定其萘殘留量，計算萘降解率。其中，溫度可設為 20、25、30、35、40 ℃;初始pH 值可設為為 5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5;鹽度(NaCl)為 0、2、5、10、15、20、30、40 g/L;萘濃度分別為50、100、200、500 和800 mg/L。

1.7 菌株對不同底物的降解效應

以苯酚、甲苯、苯甲酸、1-萘酚、丙酮、辛烷為試驗底物，經0.45 μL過濾除菌后以0.01%的量分別加入到100 mL無機鹽培養基中。接菌液0.5 mL，并設空白對照，30℃下搖床培養3 d，測定其OD600值。

1.8 菌株對原油各組分的降解效應［14］

在100 mL無機鹽培養基中加入0.45 μL濾器過濾除菌的原油0.5%，制成原油培養基。接菌液0.5 mL，并以不接菌的原油培養基作為對照，30℃搖床培養3 d，加入10 mL石油醚(沸程30～60℃)萃取，并將培養液5000 r/min離心10 min，轉至分液漏斗，振蕩數次，靜置分層后，收集上層液，用石油醚洗滌3次后，用無水NaSO4脫水，65℃蒸干，置于干燥器中冷卻。將回收得到的殘油溶解在石油醚(沸程30～60℃)中，通過GC-MS分析烷烴變化。GCMS(色譜柱 HP-5 M5，30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)運行條件:采用分流進樣，進樣口溫度為290℃，檢測器溫度為300℃，柱溫80℃，恒溫5 min，以3℃/min升溫至290℃，保留10 min;載氣為He，流速1 mL/min。

1.9 菌株降解途徑的分析

將菌株接種于含萘無機鹽培養基中，培養4 d，分別在 0、12、16、20、24、28、32、36、42、48、60、72 和96 h時取樣，于4℃、12500 r/min離心20 min，取上清液用Spectrumlab 54紫外可見分光光度計(UVVis)對萘降解中間產物進行分析檢測。波長掃描范圍為200～500 nm，掃描光譜帶寬為2 nm，繪制掃描圖譜［15］。

2 結果與討論

2.1 高效萘降解菌的篩選和鑒定

經過反復的富集篩選，以及初步的萘降解率測定，從石油污染土樣中分離到一株高效萘降解菌，命名為W1，其菌落為白色透明，中間略突起，邊緣不規則，表面光滑濕潤。菌株的透射電鏡結果顯示，菌體呈橢圓形，具鞭毛(圖1)。菌株為革蘭氏陽性菌，其部分生理生化特性見表 1。其16S rDNA的BLAST結果顯示，該菌與沙雷氏菌屬的同源性均在97%以上，綜上結果，鑒定該菌為沙雷氏菌屬(Serratia sp.)。

圖1 菌株W1單菌落形態和電鏡照片Fig.1 Shape of individual bacterial colony and transmission electron micrograph of strain W1

表1 W1菌株的部分生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain W1

2.2 菌株的生長曲線

每隔2 h測定菌株在LB培養基中的生長情況，其生長曲線如圖2所示，菌株在0～6 h為遲滯期，6～18 h為對數期，12 h后進入穩定生長期，后續試驗，接種時間均取自對數期。每隔6 h測定菌株在萘無機鹽培養基中的生長情況，由于萘對菌株的毒害作用，菌株遲滯期持續18 h，而后逐漸適應，46 h時達到最大生長量，在66 h進入明顯的衰亡期，其穩定期約持續20 h。

圖2 菌株W1在LB培養基(A)和萘培養基(B)中的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain W1 on LB medium and naphthalene medium

2.3 菌株降解特性的分析

2.3.1 溫度對菌株的影響

菌株受溫度的影響結果如圖3所示，其在30～35℃時表現出較高的萘降解率，分別達到87.5%和92.8%，而在其他溫度下，其降解率也都在40%以上，也具有一定的降解效應，說明菌株的耐受溫度范圍較寬。

2.3.2 pH值對菌株萘降解率的影響

如圖4所示，菌株的最適生長pH值為7～7.5，此時其降解率最高，達93.5%;在pH值為8時，萘的降解率為70.2%，相對pH 7～7.5時低，但仍高于其在酸性環境下的降解率，pH 8.5時，降解率下降到10.3%，降解效應極低?？梢钥闯鼍甑膒H值耐受范圍為7～8，耐堿性高于耐酸性。

2.3.3 鹽度對菌株萘降解率的影響

由圖5可以看出，一定的鹽度可以促進菌株的降解效應，過高的鹽度會抑制菌株的生長，當NaCl含量為40 g/L時，菌株的生長受到嚴重抑制，其萘降解大幅度下降，僅為30.8%。

2.3.4 底物濃度對菌株萘降解率的影響

如圖6所示，在萘濃度為100 mg/L的培養基中，菌株的降解率最高達到94%，而后隨著濃度的增加，萘對于菌株的毒害作用加大，降解率逐漸降低，但在萘濃度為800 mg/L時，菌株仍表現出一定的降解效應，其降解率為15.8%。

2.4 菌株對不同底物的降解效應

由表2可見，菌株在一定濃度的苯酚、甲苯、苯甲酸、1-萘酚、丙酮和辛烷底物環境中均能達到一定的生長量，雖生長量有限，但表明該菌株具有較廣的底物利用范圍，可以適應復雜的底物環境。

表2 W1菌株降解不同底物的吸光度值Table 2 Biomass production of strain W1 degradating different substrates

2.5 菌株對原油組分的降解效應

不接菌空白與接菌培養后的原油培養基殘留組分GC-MS分析，以質譜譜庫NIST MS檢索結果定性，其結果如圖7所示。原油降解后組分發生變化，C20～C23、C33～C36組分含量明顯降低，說明該菌株對該范圍內的鏈烴具有較高的降解利用效率。

圖7 不接菌空白及接菌培養基原油的GC-MS圖譜Fig.7 GC-MS of crude oil before and after degradation by stain W1

2.6 菌株降解中間產物的分析

菌株萘降解中間產物的UV-Vis的掃描結果如圖8所示，降解0 h時，250～300 nm出現吸收峰，降解12 h以后該吸收峰消失，此處為萘的吸收標志峰。隨著降解的進行，在20～28 h時，200～266 nm出現較多吸收峰，為生成的中間產物，312和378 nm處出現2個標志峰，并逐漸增大。36～96 h，312和378 nm處的吸收峰逐漸減小，培養72 h時，218 nm處出現一個吸收峰，96 h時該峰消失。綜上分析，312、378和218 nm處吸收峰所代表的物質分別為鄰苯二酚、水楊酸和2-羥基粘康酸半醛［16］。

圖8 萘降解中間產物的UV-Vis掃描圖譜Fig.8 UV-Vis of metabolic intermediates at different degradation stages

3 結論

從石油污染的土壤中分離得到能夠以萘為唯一碳源生長的石油降解菌W1，經鑒定為沙雷氏菌屬，W1的最適培養條件為35℃，pH為7.5，其生長溫度范圍較寬，并表現出一定的耐酸耐堿性。特別是W1能耐受30 g/L的鹽度，與其他已報道萘降解菌相比，有著明顯較高的耐鹽能力。在萘底物濃度為100 mg/L時，其降解率可達到94%，雖然隨底物濃度的增加其降解作用逐漸減弱，但在萘濃度800 mg/L時仍表現出15.8%的降解率。在底物利用方面，該菌在以一定濃度的苯酚、甲苯、苯甲酸、1-萘酚、丙酮、辛烷為底物時均能表現出一定的、有限的生長量，具有一定的底物利用廣度。再者，菌株的石油組分利用較廣，GC-MS分析可以看出，W1對原油中的組分C20～C23、C33～C36的直鏈烴均有較好的降解作用。經初步分析，該菌的萘降解過程為一條典型的萘生物降解途徑，萘經雙加氧酶催化降解作用，依次生成 1，2-羥基萘，鄰-羥基-順-苯丙酮酸，水楊酸，鄰苯二酚，2-羥基粘康酸半醛，最終進入三羧酸循環(TCA)生成二氧化碳和水［17，18］，最終的降解過程尚需進一步實驗驗證。

綜上所述，與其他已報道的萘降解菌相比，菌株W1有著一定的優勢。首先，其生長溫度范圍較寬，并表現出較廣的耐酸耐堿性，因其為濱海鹽堿地土壤中篩得，有著明顯較高的耐鹽能力，這對于濱海鹽堿地的石油污染的治理有著特殊的意義。在底物利用方面，該菌亦存在優點，其對原油中的組分C20～C23、C33～C36的直鏈烴均有較好的降解作用，同時該菌對多種有機底物均具有廣泛的降解作用，具有一定的底物利用廣譜性，在治理復雜有機污染時，有著相當的應用潛力。因此，對于該菌的研究為針對性的鹽堿地石油污染的生物治理提供了實驗和理論基礎。

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