響應面法優化唐古特白刺種子總黃酮超聲提取工藝

胡 娜，楊仁明，何彥峰，王洪倫，王小艷，索有瑞*

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;2中國科學院研究生院，北京 100049

白刺(Nitraria)是蒺藜科(ZygophyUceae)的旱生或超旱生典型荒漠植物［1］，是西部蒙、藏、維等少數民族的傳統藥材，其果實具有較高的藥用價值，可治療胃病，有助于消化，還可治傷風感冒、頭痛頭暈［2］，具有降血糖、降血脂、抗氧化等作用［3］。研究表明，其藥理活性與其果實中豐富的黃酮類、花色苷、總糖、維生素E及必需氨基酸等活性成分有關［5-7］。其中白刺總黃酮具有降低血清、肝組織中的MDA，增強其SOD、GSH-PX的活力，延緩衰老的作用［8］。

目前白刺種子中黃酮類化合物的提取方法主要有加熱回流提取和索式提取，具有提取時間長、有機溶劑消耗量大、提取效率低等缺點。超聲波提取是利用超聲波在液體中產生“空穴作用”，破壞植物細胞和細胞膜結構，從而增強細胞內容物通過細胞膜的穿透能力，有利于黃酮類化合物的釋放與溶出［9］。

本研究在單因素試驗的基礎上選擇乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度3個主要因素，以總黃酮提取得率為響應值，采用響應面法對唐古特白刺種子中總黃酮超聲輔助提取工藝進行了優化。以期為研究唐古特白刺種子總黃酮的超聲提取路線提供參考，為唐古特白刺的進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白刺果實采摘于柴達木盆地，由中國科學院西北高原生物研究所盧雪峰博士鑒定為唐古特白刺(Nitraria tangutorum Bobr.)的果實;蘆丁，購自成都曼斯特生物科技有限公司(批號:MUST-11040302);石油醚、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFY1000C高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司;UV-759型紫外-可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司;KQ-250DB型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司;101-1ES型電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器廠;優普UPT系列超純水器，成都超純科技有限公司;ALC-110.4型電子天平，德國Acculab公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

將榨完果汁剩下的果渣進行清洗，去除果皮，保留種子，并將洗干凈的白刺種子于60℃烘箱中烘至恒重。取200 g干燥好的白刺種子，用高速萬能粉碎機粉碎，過32目篩，備用。

白刺種子除油脂:取100 g過篩后的白刺種子粉末，用石油醚索氏提取3次，每次2 h，待石油醚揮發完全后置于電熱鼓風干燥箱中45℃條件下烘干，備用。

精確稱取除脂后的白刺種子2.0 g置于100 mL圓底燒瓶中，按照一定的液料比、乙醇濃度、超聲時間和超聲溫度進行超聲提取，提取完成后過濾并用60%乙醇定容至50 mL容量瓶中，即為樣品溶液。

1.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標準品5.0 mg，加入60%的乙醇溶液，定容至50 mL的容量瓶中，搖勻，配制成0.1 mg/mL 的標準品溶液，分別取溶液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加30%乙醇至5 mL，再加入0.3 mL 5%的 NaNO2溶液，搖勻放置6 min后再加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻放置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH溶液，加水至刻度，搖勻放置15 min，在510 nm處測定其吸光值，以蘆丁濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度值A為縱坐標作回歸曲線，得回歸方程為 A=12.792C-0.0035(R2=0.9990)。

1.3.3 總黃酮提取得率的計算

將測得的吸光度值代入回歸方程計算總黃酮含量，即可求出樣品溶液中總黃酮含量C，再代入下式計算白刺種子總黃酮提取得率。

式中:V為定容體積(mL)，M為稱取的白刺種子的質量(g)，C為樣品溶液中總黃酮的含量(mg/mL).

1.4 提取條件的優化設計

根據前期試驗篩選，本試驗主要研究乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度三個因素對響應值的影響，首先進行單因素試驗。單因素試驗只考察多個因素單獨對響應值的影響，不能反映出多個因素之間相互作用的影響。通過單因素預試驗，應用 Design-Expert8.0軟件，設計3因素3水平的響應面試驗，利用響應面試驗結果，確定唐古特白刺種子總黃酮超聲提取的最佳提取條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平表Table 1 Levels and code of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對總黃酮提取得率的影響

圖1 不同液料比對白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.1 Effects of ratio of material to water on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(乙醇濃度75%，時間60 min，溫度40 ℃)考察液料比(5、10、15、20、25 mL/g)對白刺種子總黃酮提取得率的影響。結果如圖1所示，在5～15 mL/g液料比范圍內，總黃酮提取得率隨液料比的增加而呈上升趨勢，這是因為溶劑用量越大對成分的溶解能力越強，黃酮類化合物在大劑量的溶劑中始終成“稀溶液”狀態，利于擴散的進行。在液料比為15 mL/g時，總黃酮提取得率達到最大，說明一定比例的溶劑已將有效成分基本溶出完全。因此，從成本和能耗方面考慮，液料比選擇在15 mL/g為宜。

2.1.2 乙醇濃度對總黃酮提取得率的影響

圖2 乙醇濃度對白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(液料比15 mL/g，溫度40℃，時間60 min)，考察乙醇濃度(45%、55%、65%、75%、85%)對白刺總黃酮提取得率的影響。結果如圖2所示，在乙醇濃度為45% ～65%的范圍內，總黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加而增加。但當乙醇濃度大于65%時，總黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加而減小。因而，結合得率和成本考慮，應選擇濃度為65%的乙醇提取白刺種子總黃酮。

2.1.3 超聲時間對總黃酮提取得率的影響

圖3 不同超聲時間對白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(液料比15 mL/g，乙醇濃度75%，溫度 60 ℃)，考察超聲時間(20、40、60、80、100 min)對白刺種子總黃酮提取得率的影響。結果如圖3所示，總黃酮提取得率隨時間的增長呈上升趨勢，60 min附近達到最大，之后趨于平緩，說明提取液內有效成分濃度已達到平衡。為減少能耗，節約時間，超聲時間選擇60 min左右為宜。

2.1.4 超聲溫度對總黃酮提取得率的影響

圖4 不同超聲溫度對白刺種子總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction ratio of the total flavonoids in Nitraria tangutorum Bobr.

固定其它條件不變(液料比15 mL/g，乙醇濃度75%，時間60 min)，考察超聲溫度 20、30、40、50、60℃對白刺種子總黃酮提取得率的影響。結果如圖4所示，在40℃之前，隨著溫度的升高，總黃酮提取得率逐漸增加，且增幅明顯，40℃時達到最大，之后略顯下降。這一趨勢可能是由于溫度過高，總黃酮類物質分解，使其得率下降，且在工業生產中，過高的超聲溫度耗能較大而不易操作，因此選擇溫度為40℃左右為宜。

2.2 響應面法優化白刺種子總黃酮工藝

2.2.1 響應面分析方案與結果

通過上述的單因素分析，我們篩選出了乙醇濃度、超聲時間、超聲溫度三個主要因素，采用Box-Behnken設計結合響應面法，以總黃酮提取得率為響應值，對影響超聲提取白刺種子總黃酮的工藝進行優化，試驗結果見表2。

表2 試驗設計與結果Table 2 Optimization of extraction conditions and results of experimental design

采用Design-Expert8.0軟件對各因素進行回歸擬合，得回歸方程:總黃酮提取得率 =1.17+0.03X1+0.065X2+0.048X3+0.02X1X2+0.01X1X3+0.025X2X3-0.16-0.079-0.13

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA of regression analysis

表3中的回歸模型方差分析的結果表明:X1、X2、X3、X1X1、X2X2、X3X3(P ＜ 0.01)為極顯著項;X1X2、X2X3(P ＜0.05)為顯著項;X1X3項不顯著。R2=0.9936表明該二次回歸得到的白刺種子總黃酮提取得率模型與實際擬合較好，符合度為99.36%，說明使用該方程模擬實際的三因素三水平分析是可行的。同時，由 F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對總黃酮提取得率影響的順序為超聲時間(X2)＞超聲溫度(X3)＞乙醇濃度(X1)。

圖7 Y=f(X2，X3)的響應面與等高線Fig.7 Responsive surfaces and contours of Y=f(X2，X3)

2.2.2 因素間的交互影響

根據擬合模型繪制總黃酮提取得率響應面的三維圖與等高線，可直觀地看出響應面的最高點，即參數范圍內的極值以及因素間的相互作用對響應值的影響，依次可以確定最佳工藝參數范圍。Design-Expert8.0軟件處理后三維響應面和等高線圖見圖5～7。

分析3組圖可知，超聲時間、超聲溫度對總黃酮提取得率的影響較為顯著，表現為曲線較陡，即隨著超聲時間、超聲溫度的增加或減少，響應值變化較大;乙醇濃度對總黃酮提取得率的影響不大，表現為曲線較為平滑，即隨乙醇濃度增加或減少，響應值變化較小。圖5和圖7的等高線圖呈明顯的橢圓形，說明超聲時間和乙醇濃度的交互作用以及超聲時間和超聲溫度的交互作用顯著。圖6的等高線圖不呈橢圓形，說明乙醇濃度和超聲溫度的交互作用不顯著。

2.2.3 白刺種子總黃酮提取工藝條件的確定

通過軟件Design-Expert 8.0求解方程，得出了最優提取工藝條件為:乙醇濃度為65.7%，超聲時間為67.6 min，超聲溫度為41.7℃，在此工藝條件下白刺種子總黃酮得率可達1.21%。

2.2.4 工藝驗證

綜合考慮時間、成本等因素，對工藝參數進行了一定的修正，確定適宜的提取工藝條件為:乙醇濃度為66%，超聲時間為68 min，超聲溫度為42℃。在此條件下，進行了3次重復試驗，白刺種子平均總黃酮提取得率為1.20%，與預測值基本吻合。

3 結論

通過Box-Behnken中心組合試驗設計得到超聲提取白刺種子總黃酮的優化工藝條件:乙醇濃度為66%，超聲時間為68 min，超聲溫度為42℃，總黃酮提取得率為1.20%。結果表明，采用響應面法優化白刺種子總黃酮的提取工藝條件具有實際應用價值，為唐古特白刺的進一步開發利用提供了理論依據。

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