離子液體優化高速逆流色譜法分離槐花中的黃酮類化合物

朱曉娜，曹偉偉，李明靜，2*

1河南大學化學化工學院;2河南省天然藥物與免疫重點實驗室，開封 475004

槐花(Sophora japonica)又名槐蕊，為豆科植物槐的干燥花朵及花蕾，其中主要的黃酮類化合物是蘆丁(Rutin)和槲皮素(Quercetin)［1］。研究表明，蘆丁具有抗心肌缺氧、缺血、抗心律失常、降低血清膽固醇、抑制血小板集聚、抗潰瘍、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗輻射、抗病毒和增強免疫力等功能［2］。槲皮素除了有抗腫瘤、抗血小板聚集和抗氧化的作用外，還具有保護糖尿病的腎臟、腸粘膜、抗憂郁、抗心胸肥大、降壓等作用［3］。分離制備槐花總黃酮中的活性成分為進一步研究黃酮類化合物藥效作用機制和開發新的天然藥物具有重要的意義。

目前，槐花的提取分離主要采用重結晶法和柱色譜法，分離周期長，消耗溶劑多，操作復雜。高速逆流色譜(High speed counter-current chromatography，HSCCC)作為一種新型分離純化技術，采取液—液分配體系，克服了由固相載體帶來的樣品損失、失活、變性等缺點，操作方便，已被廣泛應用于天然產物活性成分的分離純化［4，5］。許有威［6］等用以乙酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3，v/v)為溶劑系統，建立了高速逆流色譜分離槐花中蘆丁的方法。此方法簡便，但是耗時較長。離子液體［7］，是一種在室溫下完全由離子組成的有機液體物質，作為一種環境友好的溶劑，可取代揮發性溶劑，被廣泛應用于電化學、有機合成、生物化學以及分離等領域［8］。但離子液體應用于逆流色譜的報道很少。本文采用超聲提取從槐花中得到粗提物，再經HSCCC進一步分離得到蘆丁和槲皮素(純度都高于97%)。同時以離子液體作為高速逆流色譜流動相添加劑，縮短了出峰時間，提高了分離度，達到理想的分離效果，為槐花黃酮的進一步開發利用提高了一種快速實用的新方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TBE-300A型高速逆流色譜儀(中國上海同田生化技術有限公司);AKTA purifier泵及紫外檢測系統(美國GE公司);Agilent 1100 HPLC儀(美國Agilent公司);超聲波清洗器(上海現科儀器有限公司);DZF-6000型真空干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司);冷凍干燥機(Martin Christ Alphal-2，German)。

1.2 試劑

氯仿、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、冰醋酸等均為分析純，高效液相色譜所用的甲醇為色譜純，均為天津市四友精細化學品有限公司;水為二次蒸餾水;［BMIM］［PF6］:1-丁基-3-甲基咪唑六氟化硼酸購于上海成捷化學有限公司。

1.3 材料

槐花購于開封市中醫院，40℃烘干，粉碎，用60%乙醇溶液，料液比1∶15(g/v)超聲提取30 min，提取3次，合并濾液，減壓濃縮至醇干［9］，放置沉淀24 h，離心沉淀，冷凍干燥，得槐花總黃酮粗提物(總黃酮純度約為60%)。

2 實驗方法

2.1 溶劑體系及樣品溶液的配制

在分液漏斗中配制正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)兩相溶劑體系，充分震搖后在室溫下靜置12 h。使用前將上相和下相分離，超聲脫氣30 min，冷卻、待用。稱取50 mg槐花總黃酮粗提物，用溶劑體系的上下相各4 mL超聲溶解，備用。

2.2 高速逆流色譜法分離制備

開啟恒溫循環器，設定溫度為25℃。以10 mL/min的流速將上相泵入主機，當固定相充滿主機管道后，改用2 mL/min的流速泵入下相，同時啟動主機，設置轉速為800 rpm。待流動相流出約20 mL后，說明體系已達平衡。開啟AKTA purifier檢測系統，設置檢測波長，待基線穩定后，將樣品溶液注入主機。流出物在256 nm波長下進行檢測，記錄色譜圖，收集目標成分，經真空干燥箱干燥后，稱重，然后經高效液相鑒定純度。

2.3 高效液相色譜分析條件

色譜柱:Agilent Zorbax SB C18(150 mm ×2.1 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶0.02%-磷酸水溶液(50∶50，v/v);檢測波長為255 nm;柱溫為30℃;進樣量為 15 μL;流速為 0.03 mL/min。

3 結果與討論

3.1 溶劑體系選擇

溶劑體系的選擇在高速逆流色譜分離中至關重要。根據色譜理論，利用高速逆流色譜進行樣品分離時，樣品在互不相溶的兩相中的分配系數在0.5-2之間，兩相溶劑體系分層時間小于30 s［10］。本文采用TLC、HPLC測定。

3.1.1 薄層色譜法(TLC)

選取乙酸乙酯∶氯仿∶甲醇∶水;氯仿∶甲醇∶水;正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水;正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水四個體系。分別配制不同比例的上述四個體系，取上下相各5 mL，加入5 mg槐花總黃酮粗提物，超聲溶解后轉移至分液漏斗中，靜置分層，取等量的上、下相薄層展開，根據展開劑乙酸乙酯∶水∶冰醋酸(8∶1∶1，v/v)展開后，斑點的位置、大小、顏色的深淺粗略判斷目標產物在上、下相中的分配情況。

TLC結果表明:溶劑體系為氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)時，目標化合物在溶劑體系的上下相中溶解程度相近。通過薄層色譜對溶劑體系的初步篩選確定氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v);正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)為分離體系。

3.1.2 高效液相色譜法(HPLC)

稱取5 mg槐花黃酮粗提物溶于事先平衡好的兩相溶劑(上、下相各5 mL)，超聲使樣品充分溶解，靜置平衡，取上下相各3 mL，蒸干，用色譜級甲醇溶解，經HPLC檢測，并計算出各目標化合物的分配系數(K=Aupper/Alower，A為目標峰面積)，結果見表1。

由表1可知，樣品在正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)溶劑體系中的分配系數在0.5 ～2 范圍內，通過HSCCC預分離后，化合物之間可以分離，但分離時間過長。通過實驗發現，在正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v)體系中加入一定比例的冰醋酸和離子液體，可以改善分離效果。當利用正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)體系，并加入1‰的1-丁基-3-甲基咪唑六氟化硼酸(［BMIM］［PF6］)分離時，化合物分離效果較好，分離時間適中。這可能是由于所分離黃酮類化合物分子結構中含有酚羥基，在體系中加入少量的酸，讓目標樣品不電離增加有機性，從而可以改善分離效果［11］。離子液體可吸附在固定相表面，可抑制流動相的分配，從而完善峰形［12］。因此，確定正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水∶冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05，v/v)為最終使用體系，并在1000 mL上述溶劑體系中，加入1 mL［BMIM］［PF6］為流動相添加劑。

表1 2種黃酮類化合物在三種溶劑體系中的分配系數(K)Table 1 The K(Partition coefficients)values of 2 flavones in three solvent systems

3.2 高速逆流分離制備的結果

按2.2操作方法經高速逆流色譜從槐花粗提物中分離制備得到3個流分(見圖1和圖2中 a、b、c)。結果顯示，從50 mg槐花總黃酮粗提物中一次分離得到流分 a(18.2 mg)、流分 b(9.6 mg)、流分c(5.4 mg)。

圖1 不加離子液體、(B)加入［BMIM］［PF6］槐花粗提物高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC chromatograms of crude extract of Sophora japonica without ionic liquid(A)and with［BMIM］［PF6］(B)

由圖1(A＆B)可以看出，在兩相溶劑體系中，加入1‰離子液體［BMIM］［PF6］，分離效果得到明顯改善。出峰時間由85 min提前為55 min，分離度由0.9提高到1.8，已經達到完全分離。其作用機理可能是:咪唑類陽離子和目標化合物之間的H鍵起著重要作用;PF-6的電負性使得化合物出峰時間縮短;部分離子液體附著與固定相表面，抑制其他成分在流動相的分配，完善峰形［13］。

圖2 (A)槐花黃酮粗提物、(B)純化出的化合物a(蘆丁)、(C)純化出的化合物b(槲皮素)、(D)未知混合物峰的高效液相圖Fig.2 HPLC chromatograms of(A)crude extract of Sophora japonica，(B)Rutin，(C)Quercetin and(D)Impurities

3.3 純度分析

采用2.3的條件對高速逆流色譜所得到的流分a、b、c進行HPLC檢測分析，結果顯示峰a和b分別是蘆丁和槲皮素，經峰面積歸一化法計算可知純度均大于97%，峰c為未知成分混合峰。結果如圖2所示。

4 結論

本文應用高速逆流色譜法首次從槐花粗提物中一步分離制備了蘆丁、槲皮素兩種黃酮類化合物，均達到較好的分離和純化效果，利用HSCCC分離植物粗提物中的活性成分，可一步得到一種或幾種單體，此方法操作簡便、快速，有其他分離手段不可替代的優點。并首次把離子液體作為高速逆流色譜流動相添加劑，探討了其對槐花中蘆丁和槲皮素分離效果的影響，為其他黃酮類化合物的分離提供了有益的參考，進一步拓展了離子液體在色譜中的應用。

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