猴頭菌液體靜置發(fā)酵液的化學(xué)成分與細(xì)胞毒活性

鄭永標(biāo)，魯春華，許 莉，鄭忠輝，蘇文金*，沈月毛*

1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)中心，福州 350108;2山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250012;3廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門 361005

培養(yǎng)方式對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物有重要的影響。近期，我們采用液體靜置培養(yǎng)方式對(duì)食藥用價(jià)值較高的猴頭菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，對(duì)發(fā)酵液的有機(jī)粗提物進(jìn)行了細(xì)胞毒測(cè)定，發(fā)現(xiàn)猴頭菌液體靜置發(fā)酵液具有較高的細(xì)胞毒活性，為進(jìn)一步闡明其中具有細(xì)胞毒活性的化學(xué)成分，我們擴(kuò)大培養(yǎng)量，對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行分離，本文對(duì)所分離并結(jié)構(gòu)確定的化合物進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 菌種

猴頭菌(Hericium erinaceus)由福建農(nóng)林大學(xué)菌物中心謝寶貴教授提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

PD培養(yǎng)基。200 g馬鈴薯浸汁(馬鈴薯去皮，切成小塊，煮沸20 min，6層紗布過濾)，葡萄糖20 g，水 1 L，pH 自然。

1.1.3 分離介質(zhì)

柱層析硅膠(200～300目)和薄層層析板(0.20～0.25 mm，GF254)購自青島海洋化工總廠。反相硅膠(RP-18)，Merck產(chǎn)品。凝膠層析硅膠(Sephadex LH-20)，Amersham Biosciences產(chǎn)品。

1.2 儀器

中壓液相色譜儀:BUCHI。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:BUCHI，EYELA，STUART。核磁共振波譜儀:Bruker ARX 600。質(zhì)譜儀:API 2000 LC/MS，Applied Biosystems。酶標(biāo)儀:M-3550，BioRad。

2 提取與分離

2.1 猴頭菌的液體靜置發(fā)酵培養(yǎng)

猴頭菌斜面菌種先接種到裝有150 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 rpm，制備猴頭菌液體菌種。取150 mL PD猴頭菌液體菌種接種到裝有3 L PD培養(yǎng)基的大三角瓶，共培養(yǎng)9瓶，于25～28℃培養(yǎng)室培養(yǎng)54 d。猴頭菌液體靜置發(fā)酵后，過濾除去菌絲體，發(fā)酵液先真空濃縮至1 L，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層用無水硫酸鈉脫水后濃縮，再用甲醇溶解過濾，得甲醇可溶粗提物 8.3 g。

2.2 猴頭菌化學(xué)成分的純化

猴頭菌粗提物(8.3 g，褐色浸膏)用適量甲醇充分溶解，經(jīng)反相硅膠柱(170 g)層析，甲醇-水梯度(水，30∶70，50∶50，70∶30，甲醇和丙酮)分別洗脫1.5、2、3、2、1 和1 L，壓力正常后流速控制為40 mL/min，每管收集250 mL，TLC檢測(cè)合并相似的組分，分別由30%甲醇、30%甲醇、30%甲醇、50%甲醇和70%甲醇洗脫得到 Fr.1(307 mg)、Fr.2(212 mg)、Fr.3(1.3 g)、Fr.4(1.2 g)和 Fr.5(884 mg)5 個(gè)主要組分。

Fr.1(307 mg)經(jīng)適量甲醇充分溶解，經(jīng)凝膠(40 g)柱層析，甲醇洗脫，流速約為4～6 drop/min，每試管收集5 mL，相似組分合并得到兩個(gè)主要組分Fr.1.1(97 mg)和 Fr.1.2(186 mg)。Fr.1.1(97 mg)經(jīng)反相硅膠(10 g)柱層析，10%甲醇洗脫得主要組分34 mg，接著經(jīng)凝膠(40 g)柱層析，丙酮洗脫得主要組分21 mg，最后經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(10∶1)洗脫，TLC檢測(cè)得到化合物6(13 mg)。Fr.1.2(186 mg)經(jīng)反相硅膠(10 g)柱層析，甲醇-水 (7.5∶92.5，15∶85，25∶75)梯度洗脫，分別從7.5%、7.5%和15%甲醇洗脫得3個(gè)主要組分Fr.1.2.1(92 mg)、Fr.1.2.2(48 mg)和 Fr.1.2.3(36 mg)。Fr.1.2.1(92 mg)接著經(jīng)凝膠(40 g)柱層析，甲醇洗脫得2個(gè)主要組分Fr.1.2.1.1(52 mg)和Fr.1.2.1.2(20 mg)。Fr.1.2.1.1(52 mg)接著經(jīng)凝膠(40 g)柱層析，丙酮洗脫得主要組分30 mg，最后經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(8∶1)洗脫TLC檢測(cè)得到化合物3(10 mg)。Fr.1.2.1.2(20 mg)經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(20∶1)洗脫，TLC檢測(cè)得到化合物4(2 mg)和5(4 mg)。

Fr.4(1.2 g)先經(jīng)凝膠(140 g)柱層析，甲醇洗脫得主要組分40 mg，再經(jīng)凝膠(50 g)柱層析，丙酮洗脫得到主要組分2 mg，接著經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(20∶1)洗脫，TLC檢測(cè)得到化合物2(1.4 mg)。

Fr.5(884 mg)先經(jīng)凝膠(140 g)柱層析，甲醇洗脫得主要組分884 mg，接著經(jīng)反相硅膠(30 g)柱層析，甲醇-水(60∶40，70∶30)梯度洗脫，70% 甲醇洗脫得到主要組分135 mg，再連續(xù)經(jīng)凝膠柱層析，分別以甲醇和丙酮為洗脫劑，得到主要組分14 mg，最后經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮(6∶1)洗脫TLC檢測(cè)得到化合物1(6 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為白色膠狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 515.4［M+Na］+和 m/z 531.1［M+K］+)，分子式 C27H40O8;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:9.42(1H，s，H-15)，7.08(1H，d，J=5.2，H-13)，5.81(1H，t，J=8.6，H-11)，4.54(1H，d，J=5.2，H-14)，4.32(1H，d，J=7.4，H-1')，3.89(1H，dd，J=11.5，5.3，H-5'α)，3.54(1H，m，H-4')，3.37(1H，overlapped，H-3')，3.30(1H，overlapped，H-2')，3.23(1H，m，H-5'β)，2.85(1H，m，H-18)，2.65(1H，m，H-10α)，2.36(2H，m，H-2)，2.12(1H，d，J=10.7，H-5)，2.04(3H，s，H-22)，1.93(1H，m，H-10β)，1.83(1H，m，H-7α)，1.69(1H，m，H-8α)，1.58(1H，m，H-8β)，1.55(1H，m，H-1α)，1.48(1H，m，H-1β)，1.45(1H，overlapped，H-7β)，1.07(3H，s，H-16)，1.03(3H，s，H-20)，1.02(3H，s，H-19)，1.00(3H，s，H-17);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.0(C-15)，172.0(C-21)，160.3(C-13)，140.7(C-3)，138.5(C-12)，138.3(C-4)，107.7(C-1')，86.2(C-14)，78.0(C-3')，75.3(C-2')，71.2(C-4')，68.9(C-11)，67.0(C-5')，50.4(C-9)，45.9(C-6)，41.0(C-5)，39.5(C-8)，38.1(C-1)，31.3(C-7)，30.1(C-10)，29.3(C-2)，28.3(C-18)，24.9(C-17)，22.2(C-19)，21.8(C-20)，20.9(C-22)，16.8(C-16)。與文獻(xiàn)［1］核磁數(shù)據(jù)相比較，確定化合物1的結(jié)構(gòu)為二萜糖苷化合物erinacine P(圖1)，為從猴頭菌菌絲體中分離到，本文首次從猴頭菌發(fā)酵液中分離到該化合物。

圖1 猴頭菌靜置發(fā)酵液的化學(xué)成分Fig.1 Chemical structures of compounds isolated from H.erinaceus

化合物2為白色粉狀物，溶于丙酮與甲醇，ESIMS(m/z 175.4［M+Na］+)，分子式 C8H8O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:6.10(1H，d，J=2.2，H-3)，6.21(1H，d，J=2.2，H-5)，2.50(3H，s，H-7)，10.1(1H，s，H-8);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.3(C-8)，167.5(C-4)，167.2(C-2)，114.1(C-1)，146.2(C-6)，111.9(C-5)，101.5(C-3)，18.4(C-7)。與文獻(xiàn)［2］的核磁數(shù)據(jù)對(duì)比確定化合物2的結(jié)構(gòu)為 orsellinaldehyde(圖1)，orsellinaldehyde是灰樹花(Grifola frondosa)的深層發(fā)酵產(chǎn)物，本文首次從猴頭菌發(fā)酵液中分離到該化合物。

化合物3為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 171.2［M+H］+，m/z 193.1［M+Na］+)，分 子 式 C8H10O4;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.96(1H，s，H-6)，6.29(1H，s，H-3)，4.79(3H，q，J=6.4，H-7)，4.43(2H，s，H-1)，1.36(3H，d，J=6.4，H-8);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:178.7(C-4)，169.6(C-2)，152.4(C-6)，133.5(C-5)，112.4(C-3)，63.6(C-7)，60.9(C-1)，23.2(C-8)。數(shù)據(jù)分析表明該化合物為已知化合物 herierin IV［3］(圖1)。

化合物4為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 143.3［M+H］+，m/z165.2［M+Na］+)，分 子 式 C7H10O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.62(1H，s，H-3)，4.64(1H，m，H-6)，4.17(1H，d，J=16.7，H-1a)，4.13(1H，d，J=16.7，H-1b)，2.54(1H，dd，J=17.0，13.0，H-5α)，2.47(1H，dd，J=17.0，4.0，H-5β)，1.48(3H，d，J=6.4，H-7);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.7(C-4)，178.5(C-2)，100.7(C-3)，76.3(C-6)，60.4(C-1)，42.2(C-5)，19.0(H-7)。經(jīng)與文獻(xiàn)［4］核磁數(shù)據(jù)比較，確定化合物4的結(jié)構(gòu)為吡喃酮衍生物 erinapyrone A(圖1)。

化合物5為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，ESI-MS(m/z 143.0［M+H］+，m/z 165.0［M+Na］+)，分 子 式 C7H10O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.37(1H，s，H-5α)，4.51(1H，m，H-2)，3.87(1H，dd，J=12.3，3.4，H-1a)，3.76(1H，dd，J=12.3，5.0，H-1b)，2.68(1H，dd，J=17.0，14.0，H-3α)，2.35(1H，m，H-3β)，2.08(3H，s，H-7a);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.4(C-4)，176.2(C-6)，103.5(C-5)，79.9(C-2)，62.6(C-1)，36.0(C-3)，19.6(C-7)。其核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］的一致，確定化合物5的結(jié)構(gòu)為吡喃酮衍生物erinapyrone B(圖1)。

化合物6為無色油狀物，可溶于丙酮與甲醇，分子式 C8H10O5，ESI-MS(m/z209.1［M +Na］+)，1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.66(1H，s，H-3)，5.75(1H，s，H-6)，4.16(1H，d，J=16.7，H-7a)，4.07(1H，d，J=16.7，H-7b)，4.40(3H，q，J=6.5，H-8)，1.23(3H，d，J=6.5，H-9);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:170.9(C-2)，101.2(C-3)，190.2(C-4)，64.6(C-5)，81.0(C-6)，59.8(C-7)，61.0(C-8)，16.8(C-9)。其核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］的一致，確定化合物6的結(jié)構(gòu)為吡喃酮衍生物erinapyrone C(圖1)。

4 Erinacine P細(xì)胞毒活性測(cè)定

把培養(yǎng)好的HeLa細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞板計(jì)數(shù)并稀釋至細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/mL。于96孔板中接種細(xì)胞，每孔80 μL。另設(shè)3孔無細(xì)胞、僅有80 μL培養(yǎng)液的用于儀器調(diào)零的空白對(duì)照孔。置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后加入20 μL化合物erinacine P使其濃度分別為24 μM和48 μM。同時(shí)，往陽性對(duì)照孔加20 μL順鉑使終濃度為10 μg/mL，往陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔各加20 μL 培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng) 72 h，每孔加10 μL 5 mg/mL MTT。37 ℃ 反應(yīng) 3 h，每孔加 100 μL 10%SDS和0.01 mol/L HCl溶解過夜。酶標(biāo)儀比色測(cè)定(波長595 nm)。抑制率按下式計(jì)算。

Erinacine P細(xì)胞毒活性測(cè)定結(jié)果見表1。經(jīng)SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析表明，空白對(duì)照組、順鉑和48 μM erinacine P實(shí)驗(yàn)組的吸光值無顯著差異，而陰性對(duì)照組和24 μM erinacine P實(shí)驗(yàn)組差異顯著，結(jié)果說明順鉑和48 μM erinacine P完全抑制HeLa細(xì)胞的生長，抑制率為100%，而24 μM erinacine P的抑制率為88%。erinacine P顯示了較強(qiáng)的細(xì)胞毒性活性。

表1 Erinacine P的細(xì)胞毒活性測(cè)定Table 1 Cytotoxity investigation results for erinacine P by MTT assay

5 討論

猴頭菌子實(shí)體具有較高的食用與藥用價(jià)值，本文通過對(duì)猴頭菌靜置發(fā)酵液化學(xué)成分分離與活性實(shí)驗(yàn)，表明猴頭菌的靜置發(fā)酵液也具有較高的藥用價(jià)值。據(jù)報(bào)道，本文首次從猴頭菌中分離到化合物orsellinaldehyde(2)，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析表明其可誘導(dǎo)人肝癌 Hep 3B細(xì)胞凋亡的作用［2］;化合物 erinacine P(1)，erinapyrone A(4)和 erinapyrone B(5)對(duì)HeLa細(xì)胞都具有細(xì)胞毒活性［4］。猴頭菌的人工栽培時(shí)間較長，子實(shí)體生長管理影響因素較多，限制了其藥用價(jià)值的開發(fā)，本文的研究為猴頭菌的開發(fā)應(yīng)用提供了新的途徑，若進(jìn)一步研究其深層發(fā)酵生產(chǎn)具有較高藥用活性價(jià)值的化學(xué)成分的工藝，則可通過工業(yè)發(fā)酵的方式來實(shí)現(xiàn)。

1 Kenmoku H，Sassa T，Kato N.Isolation of erinacine P，a new parental metabolite of cyathane-xylosides，from Hericium erinaceum and its biomimetic conversion into erinacines A and B.Tetrahedron Lett，2000，41:4389-4393.

2 Lin JT，Liu WH.O-orsellinaldehyde from the submerged culture of the edible mushroom Grifola frondosa exhibits selective cytotoxic effect against Hep3B cells through apoptosis.J Agr Food Chem，2006，54:7564-7569.

3 Qian FG(錢伏剛).，Xu GY(徐光漪)，Du SJ(杜上钅監(jiān))，et al.Isolation and identification of two new pyrone compounds from the culture of Hericium.Acta Pharma Sin(藥學(xué)學(xué)報(bào))，1990，25(7):522-525.

4 Arnone A，Cardillo R，Nasini G，et al.Secondary mold metabolites:part 46.Hericenes A-C and erinapyrone C，new metabolites produced by the fungus Hericium erinaceus.J Nat Prod，1994，57:602-606.