牛腦海馬NGF分離純化及微量元素含量檢測

顧鵬毅，代 萌，楊 棟，高 娜，李寧禾，孫晉民*

1中國醫科大學實驗技術中心一部暨國家中醫藥管理局中藥生物工程科研Ⅲ級實驗室，沈陽 110001;2朝陽市衛生學校，朝陽 122000

神經生長因子(nerve growth factor，NGF)是神經營養因子家族中最早被發現，具有神經元營養和促進突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，其臨床應用前景廣闊。NGF對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用［1］。NGF具有多種營養性生物學效應，表現在對胚胎發育期神經元的作用，促進生后發育神經元的生長，維持成熟神經元的存活，促進神經損傷的修復與再生，對神經變性性疾病的作用，對腫瘤的潛在性治療作用，在炎性疾病中的作用以及在糖尿病周圍神經病變中的治療作用。微量元素鋅是NGF的重要結構元素，在腦中的分布不均衡，其中尤以海馬結構最高。目前，NGF的主要來源是雄性小鼠的頜下腺、蛇毒、豚鼠前列腺、牛精液等，臨床較多的采用小鼠頜下腺、蛇毒來源以及基因工程產品人重組NGF(rhNGF)，其對人的神經組織有明顯的作用，國內外文獻已有很多報道。牛腦體積較大，來源廣泛，以牛腦為原料分離純化NGF或將成為其另一重要來源。本研究從新鮮牛腦中分離純化NGF，并進行活性檢測，以期為進一步應用性研究打好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品、試劑

新鮮牛腦;標準品 rhNGF(Sigma);NGF抗體(Sigma);磷酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 6.8);醋酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 4.0);Tris-HCl緩沖液(0.05 M，pH 9.0);PC12細胞(ATCC:CRL-1721，購于中國科學院上海細胞庫)。

1.1.2 儀器

層析系統(?KTA purifier 100，GE);原子吸收分光光度計(180-80，Hitachi);電泳凝膠成像系統(CHEMI IMAGER 5500);Motic Imang Andvaned 3.2圖像分析系統等。

1.2 方法

1.2.1 粗提物的制備

取新鮮牛腦海馬，經勻漿、均質得乳白色懸濁液，離心13000 rpm ×30 min，得粗提物上清液，80%(NH4)2SO4沉淀，離心棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 6.8)溶解。

1.2.2 分離純化

將鹽析后的溶液置于透析袋中，醋酸鹽緩沖液(0.2 M，pH 4.0)透析過夜，將透析后的液體離心12000 rpm ×5 min，取上清液，用CM-FF層析柱進行離子交換層析。

1.2.3 Western Blot及活性測定

1.2.3.1 Western Blot

選用T=10%，C=3%的SDS-PAGE，一抗為兔的β-NGF單克隆抗體，二抗為羊抗兔的IgG，堿性磷酸酶顯色法顯色。

1.2.3.2 活性測定［2-5］

用PLL包被24孔板，含3%馬血清、12%胎牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度為3×103個/mL，得到PC12細胞懸液。每孔加入100 μL試樣，100 μL 0.1 M 乙醇，800 μL 細胞懸液，37 ℃，5%CO2孵育72～120 h后，顯微鏡觀察細胞形態變化。利用Motic Imang Andvaned 3.2圖像分析系統，測量細胞分化情況，選取3個視野的細胞/細胞團，分別測量每個視野中分化細胞的最長軸突的長度，計算出每個濃度下的最長軸突的平均值及標準差。以軸突生長長度大于細胞最大直徑為細胞已分化標準，計數各視野細胞，若在該濃度下≥95%的PC12細胞已分化，認為該濃度具有生物學活性。

1.2.4 微量元素的測定

利用原子吸收分光光度計測定其微量元素，根據 Zn、Fe、Cu 的標準溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL)將測定結果繪制標準曲線，并根據標準曲線分別測定粗提物和CM2組分中的Zn、Fe、Cu的含量。

1.2.5 統計學處理

利用SPSS17.0統計學軟件，進行t檢驗及χ2檢驗。

2 結果

2.1 分離純化

牛腦海馬粗提物經起始緩沖液透析過夜，再經CM柱離子交換層析，在起始緩沖液和洗脫緩沖液的作用下，得到穿透峰和2個洗脫峰:CM1峰、CM2峰，其中CM2峰在pH值陡然上升時出現，且蛋白濃度相對較高，為NGF的主要含量峰，其層析結果見圖1。

圖1 離子交換層析結果Fig.1 Ion-exchange chromatogram of bovine brain hippocampus

2.2 Western Blot及活性測定

2.2.1 Western Blot

結果顯示55 KD、70 KD左右位置有兩條清楚帶，均含有β亞基，如圖2所示。

圖2 Western Blot結果圖Fig.2 Western Blot of NGF

2.2.2 生物活性檢測

2.2.2.1 標準品測定結果

各實驗組均長出纖維突觸，靈敏度可達1 ng/mL，0.1 M乙醇有較好的促分化作用。標準品NGF在濃度1～5 ng/mL時使PC12細胞長出纖維突觸，細胞體積增大，核清晰，可見核仁。分別對1、2、4、5和10 ng/mL濃度下細胞分化情況進行測量，測量結果分別為 40.29 ± 3.43 μm、54.34 ± 12.15 μm、186.66 ± 7.91 μm、240.38 ± 32.07 μm、181.62 ±20.31 μm，5 ng/mL的濃度對PC12細胞的誘導效果最佳，見圖3-B。

2.2.2.2 分離組分測量結果

分別對標準品NGF、粗提物、透析后組分、CM1組分和CM2組分作用下的細胞分化情況進行測量，選取3個視野的細胞/細胞團，分別測量每個視野中分化細胞的最長軸突的長度，測量結果見表1，其中CM2組分作用下的細胞軸突生長情況如圖3-C所示。CM2組分促PC12細胞軸突生長作用不及5 ng/mL標準品NGF，但滿足判定標準，其效果優于2 ng/mL標準品NGF。

圖3 標準品NGF及CM2組分對PC12細胞分化的作用(A.空白對照組;B.5 ng/mL NGF標準品組;C.CM2分離組分組)Fig.3 PC12 cell differentiation effects of NGF standard and CM2 component(A.Blank control;B.5 ng/mL NGF standard;C.CM2 component)

表1 標準品NGF及分離組分的蛋白濃度和生物學活性()Table 1 Protein concentration and biological activity of NGF standard and purified components)

表1 標準品NGF及分離組分的蛋白濃度和生物學活性()Table 1 Protein concentration and biological activity of NGF standard and purified components)

*ND意為未檢測到(ND means not detected).

組分Components蛋白濃度Protein concentration(mg/mL)PC12細胞分化最長軸突長度The length of the longest axon of PC12 cell differentiation(μm)標準品NGF NGF standard 5×10-6240.38±32.07粗提物Crude extract 8.107 10.32±4.51透析Dialysis 1.105 39.21±3.43 CM2component 0.4856 107.90±10.33層析Chromatography CM1組分CM1component 0.2372 ND*CM2組分

圖4 牛腦海馬粗提物與CM2組分中Zn、Fe、Cu含量Fig.4 The content of Zn，Fe，Cu in crude extracts of the bovine hippocampus and CM2 component

2.3 微量元素測定結果

分別對牛腦海馬粗提物及CM2組分進行微量元素的測定，經t檢驗表明:牛腦海馬粗提物的微量元素中Zn與Cu含量無差別，Fe與Zn、Cu有差異(P ＜0.01)，見圖4-A;CM2組分中Zn遠高于Fe、Cu含量(P ＜0.01)，Fe與Cu含量無差異，見圖4-B。

3 討論

本實驗得到的牛腦海馬NGF的分子量在55 KD、70 KD左右，為較大分子量的 NGF，與牛精漿［6］、人胎腦、大鼠腦［7］來源的 NGF 相比，含有的亞基不同。用標準品NGF對PC12細胞誘導發現，5 ng/mL的濃度下，誘導分化效果最佳。我們據此建立促神經生長物質檢測技術平臺［3，4］，應用 0.1 M乙醇作為誘導劑，以5 ng/mL的標準品NGF濃度為陽性對照;采用圖像分析軟件，測量分化細胞的最長軸突的長度以及分化細胞的百分含量;根據對已分化細胞的直徑測量，以最長軸突大于50 μm時且分化細胞的百分含量＞50%作為標準。

必需微量元素是正常人體生命過程中不可缺少的元素，它參與人體的重要的生命活動過程，對人體的各種生理活動起影響、調節作用。鋅在中樞神經系統內有兩種存在形式，一種是與某些生物大分子牢固結合，如金屬蛋白酶中的鋅;另一種形式是與組織成份疏松結合，可以被鰲合劑螯合。鋅與機體的神經內分泌有一定關系，海馬有損傷出現時，可導致下丘腦釋放激素等活性物質的水平發生改變。鋅對腦中的一些功能蛋白有調節作用，腦中可能有一種對神經細胞增殖起抑制作用的含鋅蛋白，該蛋白與Alzheimer＇s癡呆的發生密切相關。鋅能促進酶和蛋白質合成，加速細胞的分裂和增殖，增加能量代謝、組織呼吸和保護細胞膜的完整性。微量元素鋅在腦中的分布是不均衡的，以邊緣系統、皮質部、扣帶回、齒狀回和海馬中含量較多，其中尤以海馬結構和大腦皮層含量最高，嚙齒類動物的海馬鋅含量可高達133 μg/g干重。經檢測牛腦海馬NGF中的微量元素Zn明顯高于Fe、Cu含量，這與NGF分子中含有Zn結構相一致，Zn2+具有穩定亞單位結構的作用。

神經生長因子具有促進神經纖維生長、調節神經多肽的合成和表達的作用。目前研究表明，NGF是表皮角質形成細胞增殖誘導劑［8］，對正常及瘢痕皮膚成纖維細胞的生長趨勢與增殖活性有明顯的促進作用，促進皮膚創傷修復和創面愈合，對瘢痕皮膚的作用尤為明顯［9］。陳麗華等［10］研究發現NGF可以間接調節并增強面部皮膚的免疫功能，局部創面應用后不但可以趨化各種免疫細胞，而且能對被趨化的免疫細胞致敏。有研究表明，NGF能影響肥大細胞的活性［11］，或許通過肥大細胞參與濕疹的發病。NGF作為一種生長因子，能促進細胞有絲分裂，對神經損傷有修復作用，同時還可促進傷口愈合［12］。同時還通過刺激皮膚的表皮細胞增殖、更新，刺激真皮的膠原蛋白增生以實現其促進傷口愈合等功能。我們課題組利用NGF研制的外用藥精制蛇毒酶乳膏，取得了良好的臨床效果。該項成果已獲得國家發明專利，這為NGF在外用藥方面的研究打下堅實的基礎。本研究是我們NGF研究系列之一，將為進一步深入研究提供理論依據。

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