高速逆流色譜制備玫瑰紅景天中的三種酚性化合物

馬朝陽，傅倩云，欒 霄，黃 超

1江南大學食品學院;2江南大學醫藥學院，無錫 214122

玫瑰紅景天(Rhodiola rosea)在中國和東歐國家是一種有名的傳統藥用植物，具有去疲勞、增強學習和記憶、興奮中樞神經系統、提高工作效率、耐缺氧、改善睡眠、預防高原病、抗癌等多種生理功能［1］，目前是一種很受歡迎的藥食兩用“適應原”植物。多酚是其抗氧化活性成分。目前對玫瑰紅景天酚性成分分離的主要方法是多步柱色譜［2，3］，其主要的缺點是分離過程復雜、回收率低、大量消耗有機溶劑。近來，高速逆流色譜(HSCCC)作為一種現代分離技術可以很好彌補柱色譜技術的缺陷，在天然活性成分的分離上正得到越來越廣泛的應用。

HSCCC是20世紀80年代初期發展起來的一種連續高效的液-液分配色譜分離技術。由于不使用固態支持介質，避免了因不可逆吸附引起的樣品損失、失活變性等現象，具有樣品無損失、無污染、高效、快速等優點。目前，高速逆流色譜已被廣泛應用于天然藥物成分的分離制備和中藥的分析鑒定中，應用HSCCC可以分離純化黃酮、生物堿、皂苷等有效成分［4］。同時具有制備量大，分離效果好，速度快等優勢。

目前還沒有使用HSCCC方法分離玫瑰紅景天酚性化合物的報道。本研究的主要目的是形成一種簡單有效的HSCCC方法同時純化玫瑰紅景天提取物中的三種酚性化合物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品的提取及HSCCC分離的試劑(正己烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇)均為分析純;水為二次蒸餾水;UPLC流動相為色譜純試劑;玫瑰紅景天提取物(西安小草科技有限公司)。

1.2 儀器與設備

TBE-300A高速逆流色譜儀(上海同田生化技術有限公司);?KTA泵系統配有紫外吸收檢測器和分步收集器(瑞士通用電氣醫療集團);HX-1050恒溫循環器(北京博醫康實驗儀器有限公司);WATERS ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國沃特世公司);BC-202B旋轉蒸發儀(上海貝凱生物化工設備有限公司);DL-360B超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司);TOF-MS質譜儀(沃特世公司，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶劑系統的選擇

本實驗使用UPLC法來測定三種紅景天多酚樣粗品中各組分的分配系數K值，來確定用于高速逆流色譜分離的兩相溶劑體系。測定方法如下:配得不同比例的溶劑體系10 mL，加入2.5 mg玫瑰紅景天樣品超聲溶解后靜置2 h，分別取上下相溶液2.5 mL濃干，分別用10 mL乙醇溶解后取1 mL溶液進行UPLC測定，測得上下相的峰面積為A1和A2。分配系數K則按下式計算:K=A1/A2。選取待分離組分的K值為0.2～5，且不同相鄰組分K值之比大于1.2的兩相溶劑體系作為高速逆流色譜分離過程中的兩相溶劑體系。

1.3.2 樣品前處理

稱取紅景天粗品65.00 g，水溶解后以1 BV/h上裝有1L聚酰胺樹脂的層析柱(5.6×60 cm)富集酚性化合物，上樣結束后，用1.5 BV水洗柱除去不被吸附的成分，然后用95%乙醇洗脫，洗脫物濃干得7.83 g酚性化合物，最后過裝有250 mL的硅膠柱(3.5×50 cm)，收集650 mL乙酸乙酯-甲醇(16∶1，v/v)洗脫物，濃干得2.38 g固形物，用于HSCCC分離。

1.3.3 制備兩相溶劑系統和樣品溶液

將正己烷、乙酸乙酸、醋酸、水(體積比4∶5∶4∶5)置于分液漏斗中，充分振搖后靜置24 h，將上相和下相分開，超聲脫氣20 min后使用。取150 mg的前處理后的固形物溶于15 mL上相流動相作為進樣樣品。

1.3.4 HSCCC分離

用泵將固定相(上相)以25 mL/min的流速泵入HSCCC分離柱，固定相充滿色譜柱后，打開主機，轉速定為800 rpm，以3 mL/min的流速泵入流動相(下相);待整個系統建立動態平衡后(1.5 h)，流速調為1.5 mL/min，由六通進樣閥進樣，進行HSCCC分離。分離過程中根據紫外檢測圖譜，接收目標成分，檢測波長為280 nm。收集到的各部分樣品溶液，用旋轉蒸發儀蒸干真空干燥得相應的固體成分。

1.3.5 UPLC-TOF-MS分析

將收集到的紅景天多酚各組分進行UPLC-TOFMS分析，分析條件:采用UPLCTMBEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)(Waters，USA)，流動相為乙腈(0.1%，v/v)-甲酸水溶液，梯度洗脫程序如下，0～8 min，5% ～40%乙腈;8 ～12 min，40% ～100% 乙腈。流速0.3 mL/min，紫外檢測波長280 nm，柱溫35 ℃，進樣量1 μL。

質譜條件如下:離子源為ESI，分析模式為負離子模式。脫溶劑溫度400℃，離子源溫度100℃，錐孔氣體流速50 L/Hr，毛細管電壓3000 V，樣品錐孔電壓20.0 kV，提取錐孔電壓4.0 kV，捕獲氣體流速1.5 mL/min，載氣流速24 mL/min。質譜掃描范圍m/z 100～1000。

1.3.6 三種化合物1H NMR譜測定

將三種化合物溶于氘代試劑中，其中化合物1和化合物2溶于氘代甲醇，化合物3溶于氘代氯仿中，在400MHz的 Avance核磁共振儀(Bruker，瑞士)上測定氫譜，以四甲基硅烷(TMS)為內標物。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

成功的HSCCC分離很大程度上依賴尋找合適的溶劑系統，可以提供理想的分配系數K值，實際的K值一般落在0.2～5的范圍內。參考Ito方法［5］，由于所要分離的組分可以溶于乙酸乙酯，所以溶劑系統的篩選從乙酸乙酯-水(1∶1，v/v)開始，此時三種目標成分的K值偏大(表1)，說明主要分配在上相，作為HSCCC溶劑系統不合適。溶劑系統的搜尋偏向脂溶性更強的溶劑體系-正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(1∶1∶1∶1，v/v/v/v)，而此時的 K 值又太小，目標成分很快洗出分離效果差。溶劑系統的搜尋在此基礎上往脂溶性稍弱的溶劑系統［6，7］正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(4∶5∶4∶5)，此時目標成分的K值落在合適的范圍說明可以作為HSCCC分離的溶劑系統。

表1 溶劑系統的選擇Table 1 Selection of solvent system

2.2 高速逆流色譜分離結果

在制備HSCCC分離過程中，進樣量被優化，當進樣量在80～150 mg范圍內沒有流動相和分辨率的損失，進一步增加進樣量時會導致流動相的流失使分離失敗，因此進樣量選150 mg。在分離過程中，由于化合物3的分配系數較大，意味著長的洗脫時間。所以當化合物1和化合物2洗脫出來175 min鐘后，流動相流速從開始的1.5 mL/min采用增大到3.0 mL/min，從而減小化合物3的出峰時間。三種化合物分離的HSCCC色譜圖如圖1所示。150 mg樣品經HSCCC分離后得到化合物1:68.5 mg、化合物2:8.5 mg、化合物3:45.5 mg，根據UPLC中峰面積比例可以得到它們的純度分別達到99.1%、98.5%、99.4%。三種化合物的UPLC色譜圖如圖2所示。

2.3 三種化合物的結構鑒定

三種化合物的質譜數據(圖3)和1H NMR數據如下:

化合物 1:C7H5O5，［M-H］-169.0124(error:5.5 ppm);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ;7.08(2H，s，H-2，6)。

圖1 分離三種化合物的HSCCC色譜圖Fig.1 HSCCC chromatography of pre-treated Rhodiola rosea extract

圖2 粗分離樣品及純化的三種化合物的超高效液相色譜圖，其中圖A為粗分離樣品，化合物1(圖D)為沒食子酸、化合物2(圖C)為沒食子酸甲酯、化合物3(圖B)為山奈酚Fig.2 UPLC chromatograms of the pre-treated crude extract(A)，the purified compound 1(D)，compound 2(C)and compound 3(B)

化合物2:C8H7O5，［M-H］-183.0293(error:5.5 ppm);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.06(2H，s，H-2，6)，3.90(2H，s，-CH3)。

化合物3:C15H9O6，［M-H］-285.0399(error:5.2 ppm);1H NMR(400 MHz，CDCl4)δ:8.11(2H，d，J=8.7 Hz，H-2’，6’)，6.93(d，J=8.7 Hz，H-3’，5’)，6.40(1H，J=2.0 Hz，H-6)，6.19(d，J=2.0 Hz，1H)。

基于以上數據，三種化合物鑒定為沒食子酸(Gallic acid)［8］，沒食子酸甲酯(Methyl gallate)，山奈酚(Kaempferol)［9］。

圖3 三種化合物的電噴霧質譜圖，化合物1:沒食子酸;化合物2:沒食子酸甲酯;化合物3:山奈酚Fig.3 ESI-MS spectra of three separated constituents，compound 1:Gallic acid;compound 2:Methyl gallate;compound 3:Kaempferol

3 結論

本文應用高速逆流色譜分離玫瑰紅景天酚性化合物，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶5∶4∶5，v∶v∶v∶v)作為制備型逆流色譜分離的溶劑系統，分離得到3個酚性化合物，單體化合物的純度經高效液相色譜檢測均高于98%。將HSCCC與常規柱色譜分離方法相結合，可以提高分離效率，在天然活性成分的分離純化方面有廣闊的應用前景。

1 Panossian A，Wikman G，Sarris J.Rosenroot(Rhodiola rosea):traditional use，chemical composition，pharmacology and clinical efficacy.Phytomed，2010，17:481-493.

2 Bao WF(包文芳)，Wu WC(吳維春)，Zhang W(張薇).I-solation and identification of domestic Rose Rhodiola watersoluble components.Chin J Med Chem(中國藥物化學雜志)，2000，10:209-210.

3 Zapesochnaya GG，Kurkin VA.Glycosides of cinnamyl alcohol from the rhizomes of Rhodiola rosea.Chem Nat Comp，1983，18:685-688.

4 Han X，Zhang T，Wei Y，et al.Separation of salidroside from Rhodiola crenulata by high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr A，2002，971:237-241.

5 ItO Y.Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr A，2005，1065:145-168.

6 Ouyang XK，Jin MC，He CH.Preparative separation of four major alkaloids from medicinal plant of Tripterygium wilfordii Hook F using high-speed counter-current chromatography.Sep Purific Technol，2007，56:319-324.

7 Yanagida A，Yamakawa Y，Noji R，et al.Comprehensive separation of secondary metabolites in natural products by highspeed counter-current chromatography using a three-phase solvent system.J Chromatogr A，2007，1151(1/2):74-81.

8 Jiao QY(焦啟揚)，Wu LJ(吳立軍)，Huang J(黃建)，et al.Chemical constituents from the involucre of Castanea mollissima Blume.J Shenyang Pharm Univ(沈陽藥科大學學報)，2009，1:26-29.

9 Liu JL(劉俊嶺)，Re N(熱娜)，Du NS(堵年生).Chemical constituents from the root of Rhodila pamiera.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2000，12(3):30-33.