芳香植物廣陳皮和山奈中有翅桃蚜驅避物質的化學鑒定

李為爭，莊 麗，付國需，楊 雷，李慧玲，原國輝

河南農業大學植物保護學院，鄭州 450002

桃蚜Myzus persicae(Sulzer)又稱煙蚜，是一種常年發生危害嚴重的世界性害蟲。文獻記載的桃蚜寄主植物多達400余種［1］，且可傳播100多種植物病毒［2］。20世紀80年代以來，為了有效控制桃蚜的危害，化學殺蟲劑的使用日趨頻繁，單位面積的用藥量不斷攀升，導致桃蚜對多種殺蟲劑產生了抗藥性，同時也引發了農產品質量安全問題［3］。因此，尋求桃蚜無公害控制的新技術與新途徑受到了廣泛關注，其中利用行為調控物質控制有翅蚜向作物田的遷移、降落和定殖等生命行為，不僅可以減輕蚜蟲的危害，而且能夠抑制病毒病的發生［4-5］。如嚴建新和侯有明研究發現，芳香植物細葉桉Eucalyptus tereticornia的乙醇提取物對桃蚜的驅避率高達94.17%［6］;Hori研究了13種唇形科芳香植物精油對于桃蚜的驅避效果，發現迷迭香Rosmarinus officinalis和千里香Thymus seryllum精油在1 μL劑量時即具有驅避作用，在迷迭香精油彌散的煙草田，桃蚜種群數量比對照煙草田下降70%左右，表明非寄主植物氣味影響桃蚜在寄主植物上的降落過程，具有防治應用的潛力［7］。

然而，系統篩選活性芳香植物，并通過序貫性化學分析和生物測定，最終從植物源中找到的活性化合物仍然十分有限。迄今為止，僅發現水楊酸甲酯是對蚜蟲具有廣譜驅避性的物質［8-10］。本課題組此前測定了30種常見芳香植物材料對有翅桃蚜的驅避活性，發現姜科的山奈Kaempferia galanga和蕓香科的廣陳皮Citrus chachiensis粉末的驅避活性比水楊酸甲酯更強［4］。為了探明其中的驅避活性成分，本文采用柱層析、GC-MS等技術鑒定了這些材料中的主要驅避活性成分，并研究了這些活性成分之間的相互作用，期望為桃蚜高效驅避劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲和材料

供試昆蟲為桃蚜，在春季遷飛高峰期，從河南農業大學科教園區的桃園采集有蚜桃葉，放置在市售黃盤中，使有翅桃蚜自由分散;測定前用軟毛刷收集離開桃葉在黃盤中自由活動的有翅桃蚜，放入鋪有濕沙的8 mL玻璃小瓶內，每瓶30頭，饑餓5 h后用于測定。供試材料為廣陳皮和山奈，均購買于鄭州黃河小商品市場，經自然干燥后用FW-100型高速萬能粉碎機在1200 rpm的轉速下粉碎10 s，過40目篩，密封于Parafilm保鮮袋中備用。供試試劑D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯購買于蘇州亞科化學試劑股份有限公司，純度分別為90%和98%，柱層析用的有機溶劑乙醚和石油醚購買于天津科密歐試劑公司，分析純。

1.2 儀器設備

生物測定裝置為二項選擇式Y形嗅覺儀，主臂長20 cm，支臂長15 cm，內徑為2 cm，兩個支臂之間的夾角為60°，全套裝置采用1 cm ID的Teflon管進行連接。索氏提取器由上海亞榮化玻儀器公司生產。廣陳皮和山奈活性餾分所用分析儀器為DSQⅡ型氣相色譜-質譜聯用儀，配置DB-5 ms毛細柱(30 m × 0.25 mm)。

1.3 生物測定

生物測定在室溫22±4℃的室內條件下進行，測定時間為每日10∶00～16∶00。測定時將處理樣品和對照樣品滴加在濾紙上，并放置在與Y形嗅覺儀兩支臂的一側相連的100 mL三角瓶中，兩支臂空氣入口接活性碳空氣凈化裝置，然后取收集于小瓶中的桃蚜30頭快速接入Y形嗅覺儀的主臂入口處，打開抽氣機，氣流速度控制在0.3 L/min。并將整套裝置遮黑處理，20 min后觀察記錄進入處理支臂和對照支臂的桃蚜數量，進入支臂10 cm的個體視為做出了行為選擇反應。每次測定完成后，取出所有離心管，用電吹風機均勻吹掃Y形嗅覺儀中殘余的氣體，將兩支臂位置調換，更換材料和蚜蟲后再進行下次測定。為避免學習經歷對試驗結果可能造成的影響，每次測定均使用新挑取的蚜蟲。按下式計算不同處理對桃蚜的驅避率(Repellent percentage，Rp):

式中:Rp為驅避率，CK為對照區的桃蚜數量，Tr為處理區的桃蚜數量，采用SAS軟件的配對t測驗分析兩支臂桃蚜分布數量的差異顯著性。采用Trisyono＆Whalon給出的卡方檢驗公式判斷二元混合物的拮抗、加成或增效作用［11］。

1.4 廣陳皮和山奈索氏提取物梯度混合測試

分別稱取廣陳皮和山奈粉末30 g用80目不銹鋼紗網包裹，放入索氏提取器中用重蒸二氯甲烷提取，熱源溫度為42℃，發生5次虹吸后拆除裝置，將提取液放入旋轉蒸發儀中50℃下減壓濃縮至再無廢液滴下為止。廣陳皮精油得率為3.541%，山奈精油的得率為2.446%。分別用正己烷稀釋淋洗蒸餾瓶中的濃縮物，并定容到10 mL，用于進一步的生物活性檢驗和柱層析分離。測定時，將廣陳皮和山奈的提取物按不同的體積比配制成20 μL的樣品，滴加在濾紙條上作為氣味源，混合樣品(廣陳皮∶山奈，v/v)的比例如下:20∶0、18∶2、16∶4、14∶6、12∶8、10∶10、8∶12、6∶14、4∶16、2∶18、0∶20，共 11 個處理，分別與潔凈空氣組成配對置于Y形嗅覺儀中進行生物測定，每種混合樣品重復測定8次。

1.5 柱層析步驟

將Florisil粉在200℃下干燥2 h，冷卻至室溫后與60～90沸程的石油醚混合，填充到50 cm ×1 cm ID的層析柱柱高的2/3處，取廣陳皮或山奈提取物5 mL緩慢滴加到層析柱中，依次取石油醚和乙醚梯度混合溶劑(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10)進行淋洗，每次淋洗 10 mL，收集后分別取每餾分20 μL作為氣味源置于Y形嗅覺儀中，與潔凈空氣配對進行測定，每個餾分重復測定6次。

1.6 D-檸檬烯及反-對甲氧基肉桂酸乙酯的活性測定和相互作用分析

由于柱層析過程使兩種植物粗提物中的化學成分發生了再分配，廣陳皮活性餾分的主要成分D-檸檬烯和山奈活性餾分的主要成分反-對甲氧基肉桂酸乙酯在原材料中的含量難以估計。因此直接取D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯進行驅避活性測定。分為2 μL D-檸檬烯、2 mg反-對甲氧基肉桂酸乙酯、1 μL D-檸檬烯 +1 mg反-對甲氧基肉桂酸乙酯共3組樣品，溶于20 μL正己烷中作為氣味源，每個處理重復測定10次。

1.7 GC-MS 分析

廣陳皮活性餾分分析條件:GC進樣口250℃，分流比10∶1;柱初溫80℃，保留3 min，然后以15℃/min升至240℃，保留15 min;山奈活性餾分分析條件為:進樣口280℃，柱初溫80℃，保留1 min，以20℃/min升至250℃，保留25 min。離子源溫度為250℃，界面溫度為250℃，掃描范圍33～400 amu，碎片離子與NIST質譜庫比較確定化合物的結構。

2 結果與分析

2.1 廣陳皮和山奈索氏提取物對桃蚜驅避的相互作用測定

不同體積比的廣陳皮和山奈索氏提取物對桃蚜的驅避率如圖1所示。不同體積比的混合粗提物對桃蚜的驅避百分率之間沒有顯著性差異(F=0.94，F0.05=1.96)，但單純的廣陳皮粗提物(20/0)和單純的山奈粗提物對桃蚜的驅避率分別達59.42%和65.71%左右，與相應的天然材料粉末的驅避率相當，說明采用索氏提取器和旋轉蒸發儀的處理過程沒有使活性成分損失，提取、濃縮采用的條件是適當的。隨著2種提取物成分的雜化，對桃蚜的驅避百分率逐漸下降，以10/10等量混合的樣品對桃蚜的驅避活性最低(37.5%)，說明廣陳皮和山奈的提取物可能存在著加成作用或微弱的拮抗作用。

圖1 不同體積比的廣陳皮和山奈提取物對桃蚜的驅避率Fig.1 Repellence of different volume ratios of C.chachiensis and K.galanga extracts to M.persicae

2.2 廣陳皮和山奈柱層析產物生物活性測定

廣陳皮和山奈柱層析分離產物的生物測定結果見表1和表2。從表1可以看出，廣陳皮洗脫液中，僅餾分Fr.8對桃蚜具有極顯著驅避活性(t=5.18，t0.05=2.57;t0.01=4.03)，驅 避 率 達 到33.33%，低于圖1中廣陳皮粗提物單獨使用對桃蚜的驅避活性，可能與柱層析過程稀釋了原始濃縮物有關。從表2可以看出，在山奈洗脫液中，餾分Fr.6對桃蚜具有較強的驅避活性，驅避率達到43.75%(t=6.74，t0.05=2.57;t0.01=4.03);另外餾分 Fr.4和Fr.9也具有顯著的驅避活性，驅避率分別達到26.26%和18.89%。餾分Fr.8表現為微弱的引誘活性，且也達到了顯著性水平(t=3.48，t0.05=2.57;t0.01=4.03)，說明山奈驅避桃蚜的揮發性物質可能是一組極性差別較大的混合物，且有可能與引誘物質共存于同一材料，驅避反應的行為輸出是桃蚜對這些復雜混合物進行綜合評判的結果。

表1 廣陳皮柱層析洗脫液不同餾分對桃蚜的驅避活性Table 1 The repellent activities of the C.chachiensis fractions rinsed with different volume ratios of petroleum ether and diethyl ether

表2 山奈柱層析洗脫液不同餾分對桃蚜的驅避活性Table 2 The repellent activities of K.galanga fractions rinsed with different volume ratios of petroleum ether and diethyl ether.

2.3 廣陳皮和山奈活性洗脫液GC-MS分析

取廣陳皮提取物中具有驅避活性的餾分Fr.8進行GC-MS分析，總離子流圖和成分列表分別見圖2和表3。從表3可以看出，廣陳皮活性洗脫液中共鑒定出9種成分，含量最大的是蕓香科的特征性揮發物D-檸檬烯(39.07%)，其次是對異丙基-1-甲基苯乙醛(21.86%)，二者合計占總揮發物成分的61%左右，其他成分所占比例較低。取山奈提取物中具有驅避性的餾分 Fr.6、Fr.4和 Fr.9合并起來進行分析，總離子流圖和成分列表分別見圖3和表4。從表4可以看出，山奈活性餾分中共鑒定出21種成分，含量最大的是姜科植物的特征性揮發物反-對甲氧基肉桂酸乙酯(70.22%)和順-對甲氧基肉桂酸乙酯(19.55%)，這兩種順反異構體合計占總揮發物量的89.77%。推測D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯可能具有驅避桃蚜的活性。但由于柱層析過程中化學成分在不同餾分之間發生了再分配， 這些主成分在原始材料提取物中的含量是未知的。

圖2 廣陳皮活性洗脫液GC-MS分析總離子流圖Fig.2 Total ion chromatography of the active fractions of C.chachiensis extracts

表3 廣陳皮活性洗脫液GC-MS成分鑒定結果Table 3 The peak numbers，retention time，relative content of the active components contained in the C.chachiensis active fractions analyzed by GC-MS

圖3 山奈活性洗脫液總離子流圖Fig.3 Total ion chromatography of active fractions of K.galangal extracts

表4 山奈活性洗脫液GC-MS分析結果Table 4 The peak numbers，retention time，relative content of the active components contained in the K.galanga active fractions analyzed by GC-MS

圖4 D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯及其二元混合物對桃蚜的驅避活性測定Fig.4 Repellence bioassay of D-limonene，ethyl 4-methoxycinnamate，and their binary blend to M.persicae

2.4 廣陳皮和山奈活性餾分的主要成分驅避活性測定

由于鑒定出的多種物質難以購置，且D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯分別是廣陳皮和山奈的主要揮發物成分，因此僅測試了這兩種成分對桃蚜的驅避作用，結果如圖4所示。從中可以看出，D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯對桃蚜均具有極顯著驅避作用(t0.05=2.26，t0.01=3.25)。將二者的劑量分別減半并組成二元混合物，發現其仍對桃蚜表現為極顯著的驅避作用。從驅避百分率的比較上看，D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯混合物的驅避百分率期望值為72.20%，實測值只有44.30%(χ2=0.11 ＜=3.84)，故表現為加成作用，與上述粗提物混合測試的結果基本一致。

3 討論

當前的昆蟲化學生態研究一般集中在昆蟲與自然生長的寄主植物或非寄主植物的化學信息通訊方面。然而，從創制害蟲行為調控劑方面來看，應當進一步擴大活性物質的篩選范圍，尤其是人類經過幾千年已經篩選出的用于調料和醫藥等用途的芳香植物，這些植物一般含有豐富的精油，嗅感濃重。我們通過前期研究發現，在30種芳香植物材料對桃蚜驅避活性的系統篩選中，廣陳皮、山奈和白芷的驅避效果尤其顯著［4］，但對其中的活性成分沒有定性。本文選取廣陳皮和山奈作為供試材料，通過索氏提取、濃縮和一系列柱層析分離步驟，結合GC-MS分析，證實了廣陳皮和山奈的索氏提取物對桃蚜具有較強的驅避作用，但二者不同體積比混合物的活性沒有統計學意義上的顯著性差異，且等體積比混合的樣品驅避活性最差，說明兩種提取物存在加成效應或者微弱的拮抗作用。進一步采用乙醚和石油醚梯度混合的淋洗劑對二者進行柱層析分離，發現廣陳皮中僅石油醚∶乙醚 =3∶7的洗脫液(表1中的Fr.8)具有極顯著驅避作用;山奈中活性最強的餾分是石油醚和乙醚等量混合的溶劑的洗脫物(表2中的Fr.6)，另外還有其他一些驅避活性較弱的餾分。GC-MS分析表明，廣陳皮活性洗脫液中含量最大的是D-檸檬烯，山奈活性餾分中含量最大的是對甲氧基肉桂酸乙酯的兩種異構體。采用純化合物進行測定證實了二者對桃蚜具有極顯著的驅避活性，且二者混合表現為加成效應。

本試驗發現的驅避物質D-檸檬烯大量存在于蕓香科的柑橘類植物果皮中，多食性害蟲桃蚜也可以利用柑橘類作為寄主植物，但主要是集中在嫩葉上危害［1］，造成桃蚜選擇寄主不同部位的原因可能與嫩葉中D-檸檬烯的含量低于果皮有關，有待進一步研究予以證實。與此類似，本試驗發現姜科植物山奈揮發物的主要成分對甲氧基肉桂酸乙酯大量存在于塊根而不是地上部分，說明驅避害蟲的天然產物資源可以來自非寄主植物，也可以來自同一寄主植物上不同的部位。后者更應當受到重視，因為這種驅避性是在來自寄主的大量引誘性物質的背景下顯現出來的，與農作物田應用驅避劑的情況很相似。在寄主植物本身中發現桃蚜驅避性物質并非首例，例如，野生馬鈴薯Solanum berthaultii和栽培種馬鈴薯S.tuberosum具有A型和B型兩種腺毛，這些腺毛中倍半萜類的含量存在較大差異，盡管野外觀察到桃蚜可以在兩種馬鈴薯上危害，但對馬鈴薯植株葉片上不同部位具有選擇性［12］。此外，廣陳皮粗提物和山奈粗提物對桃蚜的驅避百分率分別達59.42%和65.71%左右，而特征性氣味物質D-檸檬烯和反-對甲氧基肉桂酸乙酯對桃蚜的的驅避百分率分別達到50.77%和43.53%，這說明盡管廣陳皮與山奈粗提物之間以及二者的主成分之間均表現為加成效應，但山奈的主成分驅避活性與粗提物相比下降了22.18%，某些次要成分例如山奈成分中保留時間為7.17 min的第10號峰(肉桂酸乙酯)可能具有增效作用，該物質相對含量較大且與主成分結構相似。

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