Toll樣受體4參與介導黃曲霉毒素G1對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的致?lián)p傷作用

楊 紅，陳成水

Toll樣受體4參與介導黃曲霉毒素G1對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的致?lián)p傷作用

楊 紅，陳成水

目的 在基因水平上探討Toll樣受體4（TLR4）參與介導黃曲霉毒素G1（AFG1）對肺泡Ⅱ型上皮細胞的致?lián)p傷生物學效應，及其作用機制和途徑。方法 分離、純化、培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞并配置3個不同濃度的AFG1液體。實驗隨機分為正常組、實驗組、溶劑對照組，每組6個樣本。正常組加入同等量的無菌生理鹽水；實驗組加入不同濃度的AFG1液（高、中、低濃度分組），溶劑對照組加入同等量的二甲基亞砜（DMSO），終濃度為0.4 ml/ L；同時處理24 h后在上述5組提取細胞mRNA，采用RT-PCR法檢測各組TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達水平。結(jié)果 正常組肺泡Ⅱ型上皮細胞上TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達量較低。實驗組經(jīng)AFG1液作用后，各項指標的表達量顯著高于正常組（P<0.05）和溶劑對照組（P<0.05），且呈濃度依賴性增高。溶劑對照組各項指標的表達量與正常對照組相比，無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論TLR4→NF-κB→炎癥介質(zhì)信號轉(zhuǎn)導通路參與AFG1對AT-Ⅱcells的損傷作用。

肺泡Ⅱ型上皮細胞；肺損傷；黃曲霉毒素G1；Toll樣受體4；核因子（NF）-κB

已有研究在整體水平和細胞水平上證實了黃曲霉毒素G1（AFG1）對大鼠肺組織和肺泡Ⅱ型上皮細胞（AT-IIcells）結(jié)構(gòu)和功能的急性影響和損傷的生物學效應[1]。通過RT-PCR技術(shù)分離培養(yǎng)的AT-Ⅱcells有TLR4mRNA的表達，受外源性刺激后表達增強，且呈一定的濃度依賴性[2]。所以，AT-Ⅱcells是AFG1作用于肺組織的靶細胞，AT-Ⅱcells上有TLR4的表達。那么，AFG1誘導AT-Ⅱcells損傷的調(diào)控機制中是否存在TLR4介導的信號通路的存在，關(guān)于TLR4信號轉(zhuǎn)導通路是否參與AFG1致AT-IIcells損傷生物學效應的研究，尚未見報道。所以，基于以上基礎，筆者等在實驗中設想將原代培養(yǎng)的大鼠AT-IIcells作為研究對象，通過不同濃度AFG1對AT-IIcells的刺激，探討TLR4信號轉(zhuǎn)導通路是否參與AFG1致AT-IIcells損傷生物學效應過程及其具體的途徑。

1 材料和方法

1.1 動物模型及分組 清潔級（SPF）雄性大鼠，體重200～250 g/只，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供。1 mg固體裝AFG1，F(xiàn)ermentek ltd由北京銳鑫農(nóng)科貿(mào)有限公司提供。將大鼠隨機分為正常組（A組）：AT-Ⅱ cells中加入同AFG1液等體積量的無菌生理鹽水。實驗組（B組）：據(jù)AFG1液作用濃度不同，分別為B1組（濃度為0.5 mg/L）、B2組（濃度為1.0 mg/L）和B3組（濃度為2.0 mg/L）。溶劑對照組（C組）：AT-Ⅱ cells中加入同AFG1液等體積量溶劑二甲基亞砜（DMSO）。每組6個樣本。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、小牛血清、瓊脂糖購自上海生物工程有限公司，胰酶、兔抗大鼠IgG、DNA酶、DMSO購自上海博蘊生物科技有限公司，Trizol試劑購自大連寶生物工程有限公司，DEPC水購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。梯度PCR擴增儀購自德國Thermo Hybaid公司，臺式超速冷凍離心機購自美國Beckman公司，水平電泳儀購自北京六一電泳廠，凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海山富科學儀器有限公司，渦旋振蕩器購自江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠，電子天平購自梅特勒-托利多儀器有限公司，制冰機購自寧波格蘭特制冷設備廠，紫光分光光度計購自美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 大鼠AT-Ⅱcells的提取 參照文獻[3]的方法，大鼠麻醉后取肺，并將肺組織置于含DNA酶液約3.5 ml的玻璃培養(yǎng)皿中，5 min中內(nèi)將其剪碎，再加入3 ml培養(yǎng)基終止后倒入離心管，用有鈣鎂緩沖液補足20 ml，于37℃水浴中快速晃動8 min，再用100、200目大小篩網(wǎng)過濾2次，過濾液分裝于2支15 ml離心管中，1000 r/min離心8 min，棄上清，沉淀加入3～5倍體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻2 min，再加入3 mlPBS后1000 r/min離心8 min，棄紅色上清，再加入PBS液吹打后1000 r/min離心8 min，棄去上清。收集沉淀細胞用2 ml DMEM+培養(yǎng)基懸浮，以備純度鑒定和細胞計數(shù)。通過純度、活力鑒定[堿性磷酸酶（AKP）染色[4]、電鏡方法鑒定[5]及超微結(jié)構(gòu)觀察]細胞，并計數(shù)后用20%DMEM完全培養(yǎng)基懸浮細胞、調(diào)節(jié)細胞濃度為（1～2）×109/L，接種于培養(yǎng)瓶和細胞培養(yǎng)板中，標記細胞名稱、日期等，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后更換為10%DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h給予不同濃度的AFG1處理。

1.3.2 AFG1不同濃度的配置及分組 AFG1常用DMSO作為溶劑來溶解，并且配置完成后其終濃度為0.4 ml/L[6]。本實驗購買的是1 mg固體裝AFG1，故用0.2 mlDMSO來溶解，得到5 g/L用DMSO溶解的AFG1。分別取不等量濃度為5 g/L的AFG1液，加入到不同量的培養(yǎng)基中換算配置出2.0、1.0、0.5 mg/L的AFG1液。實驗組分別加入AFG1 0.5、1.0和2.0 mg/L（DMSO終濃度為0.4 ml/L），溶劑對照組和正常組分別加入DMSO 0.4 ml/L和生理鹽水。24 h后收集細胞用于實驗相關(guān)指標的檢測。

1.3.3 各組有關(guān)指標的檢測 本實驗測定的指標是正常組、實驗組和溶劑對照組AT-II cells的TLR 4mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA、IL-6mRNA的表達及其表達水平的變化。采用RT-PCR法檢測，即采用Trizol試劑提取各組肺泡Ⅱ型上皮細胞的總RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以待測定的各指標引物進行PCR擴增反應。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)成像，用Quantity One分析軟件進行凝膠掃描分析，以目的基因/β-actin為該基因表達的相對值。檢測各組TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達水平及其變化。

2 結(jié) 果

正常組AT-Ⅱ cells上TLR4 mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達量較低；實驗組經(jīng)AFG1液作用后，各項指標的表達量顯著高于正常組（P<0.05）和溶劑對照組（P<0.05）,且呈濃度依賴性增高。溶劑對照組各項指標的表達量與正常對照組相比，無明顯差異（P>0.05）。各組大鼠AT-Ⅱ cells的TLR4mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA的表達量見表1；各組大鼠AT-Ⅱcells的 TLR4mRNA、NF-κBmRNA、TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達的電泳圖，見圖1～4。

表1 各組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞TLR4、NF-κBmRNA、TNF-α mRNA、IL-6mRNA表達結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞TLR4、NF-κBmRNA、TNF-α mRNA、IL-6mRNA表達結(jié)果（±s）

與A組相比，P<0.05；與C組相比，P<0.05

TLR4mRNA NF-κBmRNA TNF-α mRNA IL-6mRNA 0.319 9±0.018 38 0.493 8±0.018 48 0.383 9±0.010 76 0.568 2±0.011 97 0.463 9±0.024 09*0.665 9±0.013 62*0.419 2±0.005 38*0.910 6±0.010 55*0.564 4±0.018 63*0.825 2±0.018 51*0.490 9±0.005 61*1.043 9±0.024 55*0.635 7±0.018 72*0.884 3±0.017 80*0.534 0±0.009 98*1.108 3±0.017 20*0.399 0±0.019 22 0.507 1±0.008 74 0.393 4±0.009 30 0.607 5±0.018 16**分組 n A6 B1 6 B2 6 B3 6 C6

圖1 TLR4mRNA電泳圖

圖2 NF-κBmRNA電泳圖

圖3 TNF-α mRNA電泳圖

圖4 IL-6mRNA電泳圖

3 討 論

AFG1是生長在食物及飼料中的黃曲霉和寄生曲霉代謝的一組化學結(jié)構(gòu)類似的產(chǎn)物，可大量溶解于氯仿、甲醇、二甲基亞砜等中等極性的有機溶劑中，易被堿或強氧化劑破壞[7]。研究已證實AFG1對肺組織和細胞具有明顯的致?lián)p傷作用，AFG1作用于AT-Ⅱ cells，引起AT-Ⅱ cells結(jié)構(gòu)和功能改變，說明AFG1直接作用對肺組織及AT-Ⅱ cells具有明顯的毒性[8]。但有關(guān)于霉菌毒素致AT-Ⅱcells損傷的細胞和分子學機制等還不十分清楚。

TLRs被認為是目前哺乳動物唯一將細胞外抗原識別信息向細胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應的關(guān)鍵跨膜蛋白，該受體族作為機體炎性反應鏈的啟動蛋白。其中發(fā)現(xiàn)最早和功能相對比較清楚的是TLR4，它是TLR家族的重要成員，可以和許多內(nèi)源性及外源性配體結(jié)合，通過一系列的跨膜信號傳導通路，發(fā)揮防御和免疫調(diào)節(jié)作用。自1998年P(guān)oltorak等[9]發(fā)現(xiàn)了TLR4以來,其作為炎癥跨膜受體在感染性疾病研究領(lǐng)域中已是熱點，TLR4信號轉(zhuǎn)導通路是TLRs中的一條重要通路，與細胞凋亡、炎癥密切相關(guān)。激活TLR4信號轉(zhuǎn)導通路可能介導霉菌毒素作用于不同的靶細胞而引起的細胞毒性作用。所以探討TLR4信號轉(zhuǎn)導通路在AFG1處理AT-Ⅱ cells中的激活情況，以及在致細胞毒性中的作用，可以進一步認識AFG1致肺損傷生物學效應及其分子機制。基于以上理論基礎和之前的設想，本實驗給予不同濃度的AFG1作用于原代培養(yǎng)的大鼠AT-Ⅱ cells，通過測定各組細胞TLR4的表達量及表達水平的變化，以證實TLR4介導了AFG1致?lián)p傷的炎癥反應過程，并探討此炎癥反應過程的信號傳導通路。根據(jù)實驗結(jié)果，實驗組TLR4mRNA的表達水平較正常組和溶劑對照組明顯升高（P<0.05），且呈濃度依賴性上升，說明AFG1作用于AT-Ⅱ cells可以激活TLR4。

NF-κB存在于肺內(nèi)多種細胞，如中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞等。氧化損傷的AT-Ⅱcells內(nèi)也有NF-κB表達,肺炎癥中AT-Ⅱcells釋放的許多炎癥介質(zhì)如IL-8、IL-6、GM-CSF和TGF-β等都受NF-κB活化調(diào)控，與肺部炎癥密切相關(guān)[10]。本文結(jié)果顯示，實驗組經(jīng)不同濃度AFG1作用于AT-Ⅱcells后，NF-κBmRNA較正常組和溶劑對照組明顯升高（P<0.05），并呈濃度依賴性上升，提示在AFG1作用于AT-Ⅱ cells的過程中有NF-κBmRNA表達的增加。有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4活化可激活NF-κB。本實驗通過AFG1作用于AT-Ⅱcells后在基因水平上對TLR4mRNA和NF-κBmRNA的測定表明AFG1通過TLR4的介導,最終導致NF-κB的活化。同時證明，在肺泡Ⅱ型上皮細胞中，由NF-κB來調(diào)控的眾多的炎癥介質(zhì)中，TNF-α和IL-6最具典型意義，也是最重要的2種[11]。TNF-α和IL-6是啟動炎癥反應的關(guān)鍵因子，因此本實驗同時將這2種因子作為檢測指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFG1作用后，ATⅡcells的TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達量明顯升高,并且隨著AFG1濃度的升高而其表達量逐漸增高。此結(jié)果表明，AFG1能夠激活AT-Ⅱcells，并導致TNF-α和IL-6在基因水平上的明顯增高。根據(jù)已知TLR4的胞內(nèi)信號傳導通路，結(jié)合以上實驗結(jié)果筆者推測，在AFG1損傷AT-Ⅱcells的過程中，AFG1是通過其膜上的TLR4介導，激活NF-κB，進而促使TNF-αmRNA和IL-6mRNA表達增高的途徑來實現(xiàn)對AT-Ⅱcells的刺激作用的，即這一反應過程是通過TLR4→NF-κB→炎癥介質(zhì)這一信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)的。

目前還有研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量AFG1作用于AT-Ⅱcells也可以激活JNK蛋白激酶，增加細胞內(nèi)Ca2+，進而激活JNK信號轉(zhuǎn)導通路，部分參與介導AFG1致AT-Ⅱ細胞毒性作用[12]。因此，在AFG1致AT-Ⅱcells損傷的作用機制中有多少信號轉(zhuǎn)導通路參與其中，哪條通路占有主導地位，還需進一步研究。同時，在TLR4的胞內(nèi)信號傳導通路中，除依賴髓樣分化蛋白MyD88可將TLR4的激活和NF-κB的核轉(zhuǎn)運連接起來外，MyD88銜接蛋白則是一條TLR4非MyD88依賴的通路，在AFG1刺激AT-Ⅱcells的過程中，TLR4是具體通過怎樣的途徑來激活NF-κB，其具體機制也需進一步的研究。另外本實驗只是從基因水平上證實AFG1對AT-Ⅱcells的致炎作用機制中有TLR4介導的胞內(nèi)信號傳導通路的存在，至于該通路接下來的蛋白表達是否具有免疫作用，要通過進一步的實驗來說明。同時如何進一步深入研究其詳細的機制，利用該通路中的信號受體作為靶位，對AFG1所致的肺部炎癥進行調(diào)控是需要進一步探討的問題。

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[2012-04-09收稿，2012-05-10修回]

[本文編輯：韓仲琪 王慶法]

Toll-like receptor 4 mediated inducing-injury role of aflatoxin G1 on rat TypeⅡ alveolar epithelial

YANG Hong①,CHEN Cheng-shui.①Dept.of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital to

cells

Zhejiang University of TCM and Materia Medica,Hangzhou,Zhejiang 310005,China

ObjectiveOn gene level to explore biological effects of Toll-like receptor 4 mediated the injury role of aflatoxin on alveolar typeⅡ epithelial cells,as well as in this process role mechanisms and pathway.MethodsIn this experiment 3 groups were randomly designed.Group 1(normal group);Group 2(the experimental group),and Group 3(solvent control group),6 samples(i.e isolated, purified and cultured Type Ⅱ alveolar epithelial cells,AT-Ⅱ cells),per group.In normal group an equal volume of sterile saline was added;in experimental group(i.e Group 2)added different concetrations of AFG1 solution(i.e 2.0 mg/L,1.0 mg/L and 0.5 mg/L, as B1,B2,B3subgroups);in solvent control group (i.e Group3)added DMSO;in Group 2 and 3,the end concetration of DMSO was 0.4ml/L.Then,after treatment for 24hs,from above-mentioned 5 group extracting mRNA was taken to detect the levels of TLR4mRNA,NF-κBmRNA,TNF-αmRNA and IL-6mRNA of each group by using RT-PCR.ResultsIn normal group on alveolar TypeⅡ epithelial cells the expression of TLR4 mRNA, NF-κBmRNA,TNF-αmRNA and IL-6mRNA was lower levels.In experimental group cells after AFG1 solution acting,those related indicator expressions were significantly higher than that in normal group (P<0.05)and solvent control group (P<0.05),and a dose dependence increased.Solvent control group,in these related indicator expressions compared with normal control group,had no significant differences(P>0.05).ConclusionTLR4→NF-κB→inflammatory mediators involved in signal transduction pathway of AFG1 inducing injury of AT-Ⅱ cells.

Alveolar TypeⅡepithelial cells；Injury of lungs；Aflatoxin G1；Toll-like receptor 4；Nuclear factor (NF)-κB

book=727,ebook=101

R-33:R655.3

A

310005浙江杭州，浙江中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（楊紅）；325000浙江溫州，溫州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（陳成水）