缺血再灌注大鼠腦皮質Bcl－2、Bax和Caspase－3的動態表達

趙 航 王 敏 曲麗瑩 劉春春 蔡 睿 于海洋 安 林 薛曉飛 劉 玲

(吉林大學白求恩醫學院人體解剖學教研室，吉林 長春 130021)

近年，腦缺血再灌注損傷成為醫學界研究的熱點問題。研究顯示，在腦缺血再灌注損傷的病理變化過程中細胞凋亡是主動的可逆的過程〔1〕。因此，對腦缺血再灌注損傷引起的神經細胞凋亡機制進行深入研究具有重要意義。細胞凋亡過程受多種基因的調控，Bcl-2、Bax、Caspase-3是凋亡信號傳導途徑中重要的調控基因。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察腦缺血再灌注后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達與再灌注時間的關系，初步探討了腦缺血再灌注過程中的神經保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 氯化三苯基四氮唑(TTC)購自北京鼎國生物;RTPCR檢測試劑盒購自 TaKaRa公司;Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體均購自Santa Cruz公司;免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中衫生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 選擇健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠57只，重量250～280 g，由吉林大學動物實驗中心提供。飼養環境溫度18℃ ～22℃，光暗周期12 h。隨機分為:假手術對照組(12 只)和缺血再灌注2、6、12、24、48 h 組(每組 9 只)。缺血再灌注組制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，假手術組的手術過程與缺血再灌注組一致，但只暴露頸總動脈，并不進行插線。

1.2.2 MCAO大鼠模型的制備 應用Zea-Longa線栓法:經左側頸外動脈-頸內動脈插線建立MCAO 2 h再灌注動物模型。實驗進程中個別死亡的、蛛網膜下腔出血的大鼠剔除在外，確保每組完成實驗的動物達到7只。

1.2.3 TTC染色法 假手術組和模型組術后不同時間點各取1只大鼠，立即斷頭取腦，放在－20℃冰箱10 min待腦組織稍硬后，沿腦垂直軸做冠狀切片，片厚約2 mm，再置于2%的TTC溶液中，37℃避光孵育30 min。然后轉移至4%的多聚甲醛中固定。

1.2.4 RT-PCR檢測 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達 按照TaKaRa提取試劑盒操作說明從冷凍的腦組織(每組3只)中提取總RNA，測定RNA濃度，取1 μg總RNA進行逆轉錄合成cDNA。RT-PCR特異引物由上海生工合成，引物序列見表1。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用全自動數碼凝膠分析儀(Tanon 2500R)檢測目的cDNA。

表1 Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH 上下游引物序列

1.2.5 免疫組化檢測 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達 每組MCAO模型大鼠各3只，大鼠以37℃ 0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)200 ml心臟灌流，4℃預冷4%多聚甲醛內固定后，迅速分離大腦，置4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋并切片(5 μm)。常規脫蠟，按試劑盒說明書操作，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。

2 結果

2.1 TTC染色 TTC染色結果顯示腦缺血再灌注側腦組織有梗死灶，白色為梗死區，主要位于大腦皮質、基底節區。見圖1。

2.2 RT-PCR 假手術組 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA僅有微量表達，與其相比，Bcl-2 mRNA在缺血再灌注2 h后表達開始增多，6 h明顯增多，24 h達高峰，48 h開始減少;Bax mRNA表達較Bcl-2延后，2 h開始微量表達，6 h開始增多，增高趨勢持續至48 h;Caspase-3 mRNA從6 h后表達微量增多，12 h略有增多，24 h明顯增多，持續增高至48 h。見圖2。

2.3 免疫組織化學染色 假手術組Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細胞表達少，與其相比，Bcl-2表達的陽性細胞數在缺血再灌注后2 h開始增多，6 h陽性細胞數顯著增多，24 h陽性細胞數增多最為明顯，48 h未見減少;Bax表達的陽性細胞數在缺血再灌注后2 h微量增多，6 h開始明顯增多，增高趨勢至48 h;Caspase-3陽性細胞數在缺血再灌注后6 h微量表達12 h逐漸增多，24 h增加明顯，持續增多至48 h。見圖3。

圖1 TTC染色，白色區域為梗死區

圖2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 在缺血再灌注后 2、6、12、24、48 h 的表達

3 討論

細胞凋亡過程受多種基因的調控，Bcl-2、Bax、Caspase-3被認為是凋亡信號傳導途徑中重要的調控基因〔1，2〕。研究證實細胞凋亡有兩條途徑，分別為細胞表面死亡受體途徑和線粒體途徑〔3〕。Bcl-2家族參與線粒體途徑介導的細胞凋亡。Bcl-2和Bax是一對相互拮抗的凋亡相關因子，他們通過在線粒體外膜形成離子通道，阻止或促進細胞色素C的釋放〔4，5〕。細胞色素C自線粒體釋放入胞質，與凋亡蛋白活化因子-1(Apaf-1)、Caspase-9酶原結合，形成凋亡體。Caspase-9繼而激活下游的Caspase-3。Caspase-3主要參與細胞表面死亡受體途徑介導的細胞凋亡，是細胞凋亡下游通路的關鍵執行者，Caspase-3的激活可以引起一系列酶促級聯反應，通過破壞核骨架及細胞骨架導致細胞凋亡〔2～7〕。由此可見，Bcl-2家族蛋白是聯系細胞外凋亡途徑和細胞內凋亡途徑的重要紐帶。Bcl-2和Bax通過表達的變化調控細胞色素C的釋放，進而影響Caspase-3的激活。本研究發現大鼠局灶腦缺血再灌注損傷的12 h內，Bcl-2和Bax表達有逐漸增高的趨勢，且Bcl-2的表達早于Bax，證明了Bcl-2蛋白的表達對神經細胞具有保護作用，并且這種保護通路在損傷早期就已經啟動。本實驗結果表明，在腦缺血再灌注的不同時間，Bax生成的上調與Caspase-3的激活密切相關。

總之，本研究結果提示在腦缺血再灌注的早期調控并促進Bcl-2的表達，減少Bax和Caspase-3的表達將會對降低缺血再灌注過程中神經細胞的損傷發揮重要作用。

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