利用枯草芽孢衣殼蛋白表面展示β-半乳糖苷酶*

王賀，楊瑞金，華霄，趙偉，張文斌

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品學院，江蘇 無 錫，214122)

利用枯草芽孢衣殼蛋白表面展示β-半乳糖苷酶*

王賀1，楊瑞金2，華霄2，趙偉2，張文斌2

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品學院，江蘇 無 錫，214122)

分別將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168)芽孢衣殼蛋白CotB、CotC、CotG和CotX的啟動子和編碼序列與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)的β-半乳糖苷酶基因bgaB進行重組，構建融合表達cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重組質粒。將4種重組質粒分別轉入枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168(trp-)，獲得了能在芽孢表面展示的重組菌株PB701、PB702、PB703和PB704。經Western blot檢測，4種重組菌株均表達了預期分子量的融合蛋白，初步表明β-半乳糖苷酶被錨定在重組菌株的芽孢表面。以oNPG為底物測定4種重組菌株芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的水解能力，得到的酶活分別為0.14、0.06、0.22和 0 .20 U/mL。

芽孢，表面展示，β-半乳糖苷酶，Western blot

枯草芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)在營養匱乏、環境惡劣下，其自身的營養細胞會形成一種休眠體，即芽孢[1］。芽孢位于菌體內，由芽孢外壁、芽孢衣殼、皮層和核心構成。芽孢能忍耐一些極端環境如高溫、高壓、化學藥物。枯草芽孢桿菌是GRAS菌種之一，因而它產生的芽孢是安全無毒的[2］。芽孢表面展示技術作為新近發展起來的一門基因操作技術，已引起眾多學者廣泛關注。相對于其他表面展示技術，它雖起步較晚，但是具有操作簡單、穩定性好、安全性高的優點，因而被廣泛用于口服疫苗、醫藥和全細胞催化劑等領域[3］。

實現芽孢表面展示技術的關鍵是需要一種高豐富度、表面結合能力強的芽孢衣殼蛋白。芽孢衣殼蛋白層一般是由超過50余種的蛋白質構成，分外層和內層。目前，已被成功應用的芽孢衣殼蛋白則都是來源于外層，如CotB、CotC、CotG和CotX[4-7］。從現有的文獻報道來看，CotB和CotC常用于錨定抗原制備疫苗，而CotG則錨定酶蛋白發揮全細胞催化劑功能。通過芽孢表面展示技術將功能活性酶展示在芽孢表面作為全細胞催化劑已成當前表面展示技術研究的熱點。本研究以β-半乳糖苷酶為目標蛋白，選用CotB、CotC、CotG和CotX四種芽孢衣殼蛋白作為分子載體，將β-半乳糖苷酶展示于芽孢表面，并比較了4種分子載體的展示能力，從而篩選出能夠適合展示β-半乳糖苷酶的分子載體。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株、質粒、主要試劑

嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus IAM11001)作為PCR擴增β-半乳糖苷酶基因bgaB的出發菌株。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis 168(trp-))和大腸桿菌(Escherichia coli Top10)均為本實驗室保存，分別作為表達宿主和克隆宿主。攜帶有紅霉素抗性基因的質粒pJS700a由江蘇大學寧德剛博士惠贈。高保真Prime STARS HS DNA聚合酶、pMD-19T、各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶均購自寶生物(大連)有限公司;小型質粒提取試劑盒購自北京天澤基因生物科技有限公司;增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自北京天恩根生化科技有限公司;HRP標記的羊抗兔二抗購自Invitrogen-Life technology;兔抗β-半乳糖苷酶血清為實驗室前期制備。其他試劑均為國產或者進口分析純級。

1.1.2 培養基

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均用LB培養基培養，在需要時分別加入氨芐青霉素(50 μg/mL)和紅霉素(10 μg/mL);LB中添加1%淀粉用于篩選枯草轉化子;DSM培養基[8］誘導重組菌株產生芽孢。

1.2 cotB、cotC、cotG、cotX和bgaB的擴增

用于擴增4種芽孢衣殼蛋白和bgaB基因的引物設計見表1，其中用于擴增4種芽孢衣殼蛋白基因的下游引物中均不含有終止密碼子。

表1 實驗中用到的引物

采用上海生工細菌基因組快速提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌的染色體。擴增4種芽孢衣殼蛋白的反應程序如下:95℃5 min，95℃1 min，62℃1 min，72℃1.5 min，35循環。以bgaB-F和bgaB-R為引物、提取的B.stearothermophilus IAM11001基因組DNA為模板，通過PCR反應擴增bgaB。獲得的PCR產物經純化后分別連接于pMD-19T，送上海博尚生物技術有限公司進行測序。

1.3 DNA操作

DNA的酶切、連接和轉化大腸桿菌均按照分子克隆標準[9］方法進行。質粒DNA的小量制備、酶切產物回收均按試劑盒方法進行。

1.4 兩步法轉化枯草芽孢桿菌

采用Spizizen法[10］制備B.subtilis 168感受態細胞，其中SpII中1×CAYE所占的體積比由1%減少到0.1%。轉化完畢后涂布在含10 μg/mL紅霉素的LB平板，過夜培養后進行篩選鑒定。

1.5 枯草芽孢桿菌的淀粉酶活性分析

從平板上挑取單菌落點接在含1%淀粉的LB平板上，37℃培養12 h以上，噴灑碘液。

1.6 芽孢懸浮液的制備及其芽孢衣殼蛋白的提取

采用DSM培養基作為枯草芽孢桿菌生產芽孢的誘導培養基，具體成分參見文獻[8］。按1%接種量(V/V)轉接至DSM培養基，37℃培養24 h。收集菌體，分別用1 mol/L的NaCl和KCl洗滌菌體，最后用無菌水懸浮，加入終濃度為5 mg/mL的溶菌酶，于37℃處理2h除去營養細胞，離心去上清。參照SDSDTT法[11］提取芽孢衣殼蛋白。

1.7 Western blot分析

取1mL的芽孢衣殼蛋白溶液，加入等體積的上樣緩沖液煮沸5～10 min，離心取上清進行SDSPAGE。蛋白電泳完畢，將分離膠浸在TBST緩沖液中平衡10 min，電轉條件:80V，2 h。電轉使蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上(NC)，然后將膜在封閉液中4℃過夜。封閉后，分別加入一抗兔抗β-半乳糖苷酶血清，室溫反應2 h，然后加入HRP標記的羊抗兔二抗，最后用增強型的HRP-DAB底物試劑盒進行顯色反應。

1.8 β-半乳糖苷酶的酶活測定

以oNPG作為底物，制備的重組芽孢懸浮液為酶液進行反應。取0.8 mL的oNPG溶液(2.5 g/L)于75℃下預熱2 min，接著加入0.2 mL芽孢懸浮液進行反應，保溫5 min，然后加入1 mL 10%Na2CO3溶液終止反應。分光光度計法測定反應液在420 nm的吸光值OD420，計算產生的oNP的量。酶活單位定義為每分鐘產生1 μmol oNP所需要的酶量。

2 結果與分析

2.1 cotB、cotC、cotG 、cotX和bgaB的擴增與融合表達的整合型重組質粒的構建

以B.subtilis 168(trp-)基因組DNA為模板、以cotB-F/cotB-R、cotC-F/cotC-R、cotG-F/cotG-R和cotXF/cotX-R為引物進行PCR擴增4種芽孢衣殼蛋白基因，然后電泳回收PCR產物。以B.stearothermophilus IAM11001基因組DNA為模板和bgaB-F/bgaB-R為引物，擴增得到的產物大小為2.0 kb。上述5個PCR產物純化后與pMD-19T連接、送樣、測序。結果發現，所有序列堿基完全正確。用XbaI/KpnI酶切與pMD-19T連接的4種重組質粒，回收cotB、cotC、cotG和cotX片段，克隆到pJS700a[12］的相應位點，獲得的重組質粒分別命名為pJSB、pJSC、pJSG和pJSX。以KpnI/EcoRI雙切pMD-19T-bgaB，回收bgaB片段并克隆于上述4個重組質粒的相應位點中，得到質粒pJSBB、pJSCB、pJSGB和pJSXB(圖1)。其中每個融合基因的轉錄都受自身啟動子控制。

圖1 融合表達cotB-bgaB、cotC-bgaB、cotG-bgaB和cotX-bgaB的整合型重組質粒構建流程圖

圖2 雙酶切重組質粒pJSBB、pJSCB、pJSGB和pJSXB核酸電泳圖

2.2 重組質粒轉化枯草芽孢桿菌與轉化子的鑒定

采用修改的Spizizen法轉化枯草芽孢桿菌。首先以BglII線性化重組質粒，兩步法轉化B.subtilis 168(trp-)。重組質粒上的整合片段含有部分淀粉酶基因，與宿主菌染色體上的同源片段發生雙交換，進而將融合基因整合到染色體上。以含有10 μg/mL紅霉素的LB平板進行初篩，然后采用含1%淀粉的LB平板對重組菌進行鑒定，結果見圖3。結果顯示菌落自身及周圍被染成藍色的轉化子，表明其中的淀粉酶因融合基因插入失活，導致不能產生淀粉酶，所以菌落被碘液染成藍色。而對照菌的菌落及周圍則產生透明的淀粉水解圈。表明融合基因已被成功整合到枯草芽孢桿菌的染色體上。4個鑒定后的轉化子分別命名為PB701、PB702、PB703、PB704。

圖3 重組菌株淀粉酶活性分析。

2.3 Western blot分析表面展示β-半乳糖苷酶重組芽孢

為進一步分析β-半乳糖苷酶是否被錨定在芽孢的表面，以稀釋后的兔抗β-半乳糖苷酶血清為一抗，Western blot檢測重組菌株的芽孢衣殼蛋白。重組菌經與特異HRP標記的羊抗兔二抗反應后，加入增強型的HRP-DAB的底物試劑盒顯色反應，結果見圖4。

圖4 Western blot分析

從圖4看出，在所有重組菌株中都會出現一條在85 ku附近的雜交條帶，而空白對照則無任何雜交條帶，β-半乳糖苷酶在圖上顯示了分子量偏低的條帶。Western blot結果表明β-半乳糖苷酶利用芽孢衣殼蛋白可以被錨定在芽孢的表面。從圖4還可以看出，重組菌株PB702表達的蛋白條帶最淺，而重組菌株PB703表達的蛋白條帶最深。

2.4 重組菌株芽孢表面展示 β-半乳糖苷酶活性分析

以oNPG為底物對重組菌株PB701、PB702、PB703和PB704芽孢表面展示的β-半乳糖苷酶的活性測定結果如圖5。圖5顯示重組菌株PB702芽孢表面展示的酶活最低，而重組菌株PB703和PB704芽孢表面展示的酶活最高，分別為0.22和0.20 U/mL，表明以芽孢衣殼蛋白CotG和CotX作為分子載體展示β-半乳糖苷酶的效果更好。

圖5 枯草芽孢桿菌芽孢表面展示β-半乳糖苷酶的測定結果

3 討論

由于枯草芽孢桿菌具有較高的安全性和穩定性優點，越來越多的研究人員開始用其展示不同的蛋白或抗原。芽孢表面展示技術的關鍵是用于錨定的芽孢衣殼蛋白。雖然目前報道的已有3種芽孢衣殼蛋白用作分子載體，但是篩選新的能有效展示外源蛋白的芽孢衣殼蛋白意義仍然十分重大。本文研究了4種不同芽孢衣殼蛋白CotB、CotC、CotG和CotX作為分子載體展示β-半乳糖苷酶并測定了4個重組菌株芽孢表面展示的酶活。結果顯示重組菌株PB703芽孢表面展示的酶活最高，其次是重組菌株PB704，而重組菌株PB702則最小，表明CotG和CotX能有效地展示β-半乳糖苷酶。CotB和CotC一般被用來錨定抗原制備疫苗如破傷風毒素TTFC，大腸桿菌的不耐熱毒素B亞單位等，而CotG則被廣泛用于錨定酶制備全細胞催化劑如ω-轉氨酶、N-乙酰-D-神經氨酸醛縮酶等[13-15］。Hinc等人[16］將幽門螺桿菌尿素酶A亞單位(UreA)分別融合到CotB、CotC和CotG上，結果顯示CotC最適合UreA的表達，而CotB最適合融合蛋白在芽孢表面的展示。表明使用不同的錨定蛋白對展示的蛋白活性有較大影響，主要與錨定蛋白自身性質有關。李倩等人[7］報道了一種新的芽孢衣殼蛋白(CotX)可以作為分子載體，但未見報道用于固定生物酶。在本研究中發現，CotX可以有效地錨定β-半乳糖苷酶在芽孢表面，而且獲得較高的酶活，同時本研究可為其他酶制劑固定提供參考。

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ABSTRACTIn this work，we developed an efficient spore display system that a model protein β-galactosidase was anchored on the spore surface of Bacillus subtilis 168 based on the use of spore coat proteins.The PCR-amplifying cotB，cotC，cotG and cotX were ligated with pMD-19T and digested with XbaI and KpnI，and then subcloned into vector pJS700a previously digested with the same two restriction enzymes，finally resulted in the plasmids pJSB，pJSC，pJSG and pJSX.To construct the gene fusions，the bgaB from Bacillus stearothermophilus IAM11001 was cloned into the KpnI and EcoRI sites of plasmid pJSB，pJSC，pJS G and pJSX to generate generating the plasmids pJSBB，pJSCB，pJSGB and pJSXB，respectively After linearization with BglII restriction endonuclease，the four recombinant integrative plasmids were transformed into B.subtilis 168 to yield the recombinant strain PB701，PB702，PB703 and PB704，respectively.Results from Western blot analysis showed that the fusion protein was immobilized on the spore surface.Using oNPG as substrate，the enzyme activity of spore-displaying β-galactosidase was assayed and they were 0.14，0.06，0.22 and 0.20 U/mL for PB701，PB702，PB703 and PB704，respectively.This result suggested that the fusion proteins could be successfully expressed and located on the spore surface of B.subtilis.

Key wordsspore，surface display，β-galactosidase，Western blot

Functional Display of β-galactosidase on the Spore Surface of Bacillus subtilis Using Spore Coat Protein as Anchor Motif

Wang He1，Yang Rui-jin2，Hua Xiao2，Zhao Wei2，Zhang Wen-bin2
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

博士研究生(楊瑞金教授為通訊作者)

*國家“863”計劃項目(2006AA10Z336);江南大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向資助項目(SKLF-MB-200804);以乳糖異構化為目標的葡萄糖異構酶定向改造研究(SKLFTS-200903);江南大學博士研究生科學研究基金項目

2012-02-21，改回日期:2012-03-30