響應面法優化脈紅螺牛磺酸提取工藝研究

崔青曼，袁春營，孫會芳，白鴻達

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋科學與工程學院，天津300457）

響應面法優化脈紅螺牛磺酸提取工藝研究

崔青曼，袁春營，孫會芳，白鴻達

（天津市海洋資源與化學重點實驗室，天津科技大學海洋科學與工程學院，天津300457）

采用三元二次回歸正交旋轉組合設計，研究在自然pH條件下料液比、提取時間、乙醇濃度對脈紅螺牛磺酸得率的影響，建立各因子與牛磺酸得率關系的數學回歸模型，確定最佳提取條件為料液比1∶3（g/mL）、提取時間2 h、乙醇濃度70%。經驗證，在此條件下牛磺酸得率為0.7307%，與理論計算值0.73782%基本一致。回歸模型能較好地預測脈紅螺中牛磺酸的得率，說明響應面分析法得到的脈紅螺牛磺酸提取工藝參數真實可靠，具有一定的實用價值。

脈紅螺；牛磺酸；提取工藝；響應面法

Abstract:The effects of ratio of solvent to material,treatment time and ethanol concentration on the yield of taurine were investigated at natural pH by using quadratic orthogonal rotary composite design.The mathematical regression model of the relationships between the studied factors and the yield of taurine was constructed and the optimum extraction conditions of taurine were got that were ratio of material to solvent 1∶3(g/mL),treatment time 2 h and ethanol concentration 70%.Under these conditions,the yield of taurine was 0.7307%,which was close to the estimated value 0.73782%attained by using regression model.As the model for the yield of taurine had better prediction effects,the parameters of taurine extraction for Pulse venosa obtained by response surface methodology were true and reliable which had some practical value.

Key words：Pulse venosa;taurine;extraction technicque;response surface methodology

牛磺酸,化學名2-氨基乙磺酸，白色晶體，因從牛膽汁中首次分離而得名，它具有廣泛的生物學活性，是維持機體正常生理功能所必需的一種氨基酸。最新研究表明牛磺酸在大腦的發育、糖尿病的防治、心血管系統的保護以及延緩衰老等方面均有一定的作用[1-3]。迄今為止，國內外牛磺酸生產大多采用化學合成，但存在原料危害大、工藝復雜、回收率低、環境污染嚴重等問題，而國際市場上天然提取的牛磺酸的價格遠高于合成品，因此探索從生物中提取天然牛磺酸已成為人們研究的熱點，據報道海洋生物中牛磺酸的含量較陸地生物更加豐富[4]。脈紅螺（Pulse venosa）是我國豐富的海產貝類之一，其肉中富含蛋白質、核黃素、尼克酸、VE等營養物質及多種微量元素，有很好的食用和藥用價值，在對其軟體部牛磺酸粗提的基礎上[5]，進一步優化脈紅螺牛磺酸提取的工藝條件，為脈紅螺的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試樣

脈紅螺：購自塘沽農貿市場，殼長（65.09±3.29）mm，殼寬（51.35±2.74）mm，殼高（49.34±2.82）mm，體重（42.34±3.45）g。

1.1.2 主要儀器

RE-3000旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；GL-16M高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；DS-A組織搗碎機：上海隆拓儀器設備有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 牛磺酸的提取與純化

將脈紅螺清洗，去殼，取軟體部分，準確稱取一定質量，加入少量的蒸餾水,于組織搗碎機中制備勻漿，取勻漿液，加入一定體積蒸餾水，置于100℃的水浴中提取1 h，雙層紗布過濾后剩余殘渣再放于熱水中浸提1 h，過濾后合并2次濾液，濾液用6 mol/L HCl調至pH 3，以除去酸性蛋白質，以10000 r/min離心25 min，清液以6 mol/L NaOH調至pH 10，10000 r/min離心25 min后，濾液再用4 mol/L三氯乙酸調至pH 4～5，以10000 r/min離心25 min，將提取液調節pH=5，經H+型陽離子交換樹脂柱去除其它氨基酸和部分色素，用蒸餾水洗脫，接收pH=3～5的流出液，將收集到的洗脫液用旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮液加入無水乙醇，置于4℃冰箱，直至牛磺酸晶體析出。

1.2.2 牛磺酸提取工藝的響應面設計

采用Design Expert軟件，進行了響應面法中的Box-Behnken實驗（三因素三水平），以料液比、提取時間及乙醇濃度為自變量，以牛磺酸得率為響應值，考察3個因素對提取工藝的影響，并對提取工藝進行優化，試驗因素與設計見表1。得率計算如下：

牛磺酸得率=晶體牛磺酸質量/樣品濕重×100%

表1 因素水平編碼表Table 1 Test code and correspondingly origin level

1.2.3 數據處理

運用SAS軟件對實驗結果進行處理。

2 結果與分析

2.1 響應面實驗方差分析

表2 三元二次正交旋轉組合試驗設計及結果Table 2 The quadratic orthogonal rotary composite experimental design and experimental result

表3 二次響應面回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model of quadratic response surface

按照表1方案進行響應面試驗，結果見表2，方差分析見表3。

從表3中二次應面回歸模型的方差分析看，此模型的P＜0.01，表明得率模型在99%水平上極顯著。各項系數的P值越小，說明該項越顯著[6]，因此對于該模型來說 X1、X2、X3、X12、X22、X32是最為顯著的 6 項。失擬檢驗可以用來檢驗模型對觀察數據描述的準確性。失擬的P值（0.761472）越小，說明失擬越顯著，模型越不準確。對于一個預測模型來說，一般要求其失擬值大于0.05，即失擬在95%水平上不顯著[7]。因此，該模型的失擬結果較好。

運用SAS軟件對上述結果進行整理分析，得到如下回歸方程預測模型：

X1、X2、X3、X12、X22、X32均在 P＜0.01 水平上影響顯著，P＞0.05項對牛磺酸得率影響不大，可以忽略不計，故回歸方程可簡寫為：

2.2 響應面交互作用分析與優化

為了進一步研究相關變量之間的交互作用以及確定最優點，通過Design-Expert軟件繪制響應面曲線圖與等高線圖進行可視化的分析，結果見圖1～圖3。

圖1 料液比（X1）與提取時間（X2）對牛磺酸得率（Y1）的影響Fig.1 Effects of ratio of material to solvent(X1）and extraction time(X2)on the yield of taurine(Y1)

圖2 料液比（X1）與乙醇濃度（X3）對牛磺酸得率（Y1）的影響Fig.2 Effects of ratio of material to solvent(X1)and ethanol concentration(X3)on the yield of taurine(Y1)

圖3 提取時間（X2）與乙醇濃度（X3）對牛磺酸得率（Y1）的影響Fig.3 Effects of extraction time(X2)and ethanol concentration(X3)on the yield of taurine(Y1)

從圖1看出，當乙醇濃度為70%時，牛磺酸得率隨著料液比和提取時間的增加先升后降，提取時間對得率的影響較料液比大，圖2顯示提取時間為2 h時，牛磺酸得率隨著料液比和乙醇濃度的增加先升后降，料液比對得率的影響較乙醇濃度大，圖3顯示料液比為1∶3時，牛磺酸得率隨著提取時間和乙醇濃度的增加先升后降，提取時間對得率的影響較乙醇濃度更大。

綜合上述結果，所分析的三因素對牛磺酸得率的影響力排序為：提取時間＞料液比＞乙醇濃度，三因素之間的交互作用均不明顯。

2.3 最佳工藝條件的確定

利用SASRSREGProcedure對方程Y進行主成分分析，獲得1個穩定點，見表4。

表4 基于編碼的響應面分析（穩定點）Table 4 Response surface analysis based on coding(stable point)

分析其特征值為（-0.08974，-0.10012，-0.14889），均為負值。根據設計原理，Y有最大值。通過數據處理優化Y，得到使Y達到最大值的編碼組合，即：當X1=1∶2.87483、X2=1.87381 h、X3=67.1663%時，牛磺酸得率最大值（Y）為0.7378%。

2.4 最優條件的實驗驗證

在牛磺酸得率最高時對應的最佳提取參數及修正參數[料液比 1∶3（g/mL）、提取時間 2 h、乙醇濃度70%]條件下提取2次（驗證實驗），得到脈紅螺中牛磺酸的得率分別為0.7312%和0.7307%，得率實測值與理論預測基本吻合，說明響應面分析法得到的脈紅螺牛磺酸提取工藝參數真實可靠，具有一定的實用價值。

3 結論

1）在試驗設計范圍內，影響脈紅螺牛磺酸得率的主次順序是提取時間＞料液比＞乙醇濃度。

2）建立了一個以牛磺酸得率為目標值，以料液比、提取時間、乙醇濃度為因子的數學模型，方差分析表明其擬合好。通過對回歸方程的優化計算，得到最佳提取工藝條件：料液比 1∶3（g/mL）、提取時間 2 h、乙醇濃度70%。回歸模型可較好地預測脈紅螺中牛磺酸的得率，為開發利用海洋生物資源提供了理論依據。

3）對所建立的數學模型做驗證實驗，在最優條件下牛磺酸的得率為0.7312%，比理論值0.73782%稍低，說明該回歸模型中仍存在干擾因素。

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The Study on Optimization of Extraction Technique of Taurine from Pulse venosa by Responrse Suface Methodology

CUI Qing-man,YUAN Chun-ying,SUN Hui-fang,BAI Hong-da
(Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry,Tianjin;College of Marine Science and Engineering,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

2011-12-16

天津市塘沽區科委基金項目（2008XQ13-06）

崔青曼（1964—），女（漢），教授，博士，主要從事海洋生物資源的開發利用技術研究。