高壓脈沖電場(chǎng)作用下亞致死酵母的存在與檢測(cè)*

顧艷潔，趙偉，楊瑞金，閆文

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú) 錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

高壓脈沖電場(chǎng)作用下亞致死酵母的存在與檢測(cè)*

顧艷潔1，趙偉2，楊瑞金2，閆文1

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú) 錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

為探究高壓脈沖電場(chǎng)(PEF)對(duì)釀酒酵母的滅菌機(jī)理，研究了從亞細(xì)胞水平揭示PEF處理下的損傷亞致死酵母細(xì)胞的存在及產(chǎn)生規(guī)律。采用pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)模擬體系，30 kV/cm電場(chǎng)強(qiáng)度下循環(huán)處理100～500 μs，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)對(duì)PEF處理前后亞致死酵母細(xì)胞進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，亞致死酵母的臨界滲透壓為4%NaCl，PEF處理后，釀酒酵母的亞致死率可達(dá)到4.5個(gè)對(duì)數(shù)，亞致死細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1.5個(gè)對(duì)數(shù)，且亞致死程度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而加大。選擇性培養(yǎng)基可用于PEF處理過(guò)程中亞致死細(xì)胞的定量檢測(cè)。

高壓脈沖電場(chǎng)(PEF)，釀酒酵母，亞致死細(xì)胞，選擇性培養(yǎng)基

高壓脈沖電場(chǎng)殺菌(PEF)是一種很有工業(yè)化前景的非熱殺菌技術(shù)，以其良好的殺菌效果和最大限度保持食品營(yíng)養(yǎng)成分的特點(diǎn)而備受矚目。PEF的殺菌機(jī)理是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)，目前人們就PEF對(duì)微生物的殺菌效果已有了較深入的研究，但只局限于PEF致死微生物。研究結(jié)果表明，PEF處理對(duì)微生物的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞均有較好的殺滅作用[1］。PEF的殺菌作用與其對(duì)微生物細(xì)胞膜的影響密切相關(guān)。當(dāng)微生物被置于高壓脈沖電場(chǎng)中時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)被破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲出，引起細(xì)胞死亡[2-3］。最近研究結(jié)果表明，PEF除殺死一部分微生物外，還會(huì)形成一定比例的損傷亞致死細(xì)胞[4-5］，亞致死微生物可在適宜的環(huán)境下修復(fù)，恢復(fù)其繁殖能力，對(duì)食品安全及PEF處理食品的貨架期造成很大影響。Christine證實(shí)了亞致死微生物的存在[6］，Somolinos等人[7］研究了釀酒酵母經(jīng)PEF處理后亞致死損傷細(xì)胞的修復(fù)等問(wèn)題，證明PEF處理后釀酒酵母產(chǎn)生一定程度的亞致死損傷，其修復(fù)程度取決于處理介質(zhì)的pH和儲(chǔ)存介質(zhì)的性質(zhì)。

釀酒酵母(S.cerevisiae)是液體食品中的常見(jiàn)污染菌種，并會(huì)因?yàn)榫凭l(fā)酵和CO2氣體的產(chǎn)出而引起飲料的腐敗，同時(shí)它也是基礎(chǔ)生物學(xué)研究和食品工業(yè)中廣泛存在的菌種，是良好的研究模型。本文應(yīng)用PEF處理釀酒酵母細(xì)胞，通過(guò)選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)來(lái)驗(yàn)證亞致死細(xì)胞的存在，確定了亞致死酵母細(xì)胞的臨界滲透壓，并對(duì)亞致死細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，分析PEF處理對(duì)亞致死酵母的產(chǎn)生規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

釀酒酵母菌，江南大學(xué)食品酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，菌種編號(hào)C-03。

OSU-4L型實(shí)驗(yàn)室規(guī)模PEF連續(xù)處理設(shè)備，俄亥俄州州立大學(xué)，美國(guó);XSW-CJ-2A標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)，吳江市綠葉空調(diào)凈化有限公司;CT14D型臺(tái)式高速離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司;DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);QYC2102-C型恒溫培養(yǎng)搖床，上海新苗醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物培養(yǎng)與接種

本實(shí)驗(yàn)采用釀酒酵母作為目標(biāo)菌種，由酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂斜面培養(yǎng)基移至YPD液體培養(yǎng)基，30℃下?lián)u床200 r/min培養(yǎng)16 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體濃度達(dá)到108～109CFU/mL。將上述培養(yǎng)液于8000 r/min離心6 min，然后用電導(dǎo)率約為2000 μs/cm，pH7.2的PBS緩沖液重懸，使菌體濃度達(dá)到106～107CFU/mL。

1.2.2 高壓脈沖電場(chǎng)殺菌設(shè)備

采用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模連續(xù)PEF處理設(shè)備(OSU-4L，美國(guó)俄亥俄州立大學(xué))進(jìn)行，脈沖電場(chǎng)為雙極方形波脈沖電場(chǎng)，管路清洗采用4%NaOH、10%市售次氯酸消毒液和無(wú)菌水進(jìn)行。

1.2.3 高壓脈沖電場(chǎng)殺菌參數(shù)的選擇

實(shí)驗(yàn)選擇6個(gè)連續(xù)處理腔，選擇電場(chǎng)強(qiáng)度為30 kV/cm，總處理時(shí)間為100、200、300、400、500 μs(處理時(shí)間采用循環(huán)方式)，脈沖寬度2 μs，脈沖頻率200 Hz;循環(huán)式冷卻水浴的溫度設(shè)定為15℃。

電場(chǎng)強(qiáng)度E和總處理時(shí)間t計(jì)算方法如下:

式中，U為電壓，kV;d為電極間距，0.29 cm;Np為單個(gè)處理腔內(nèi)接收的脈沖數(shù);Nc為處理腔個(gè)數(shù)，6;Wp為脈沖寬度，s;Tr為停留時(shí)間，s;f為脈沖頻率，Hz;V為單個(gè)腔體積，0.012 cm3;F為物料流速，mL/s。

1.2.4 PEF處理對(duì)釀酒酵母菌致死率的影響

根據(jù)GB/T4789.2-2003方法，對(duì)PEF處理前后的樣品進(jìn)行菌落平板計(jì)數(shù)。殺菌效果采用致死率來(lái)表示，致死率計(jì)算公式:

式中，N為PEF處理后的微生物數(shù)，CFU/mL;N0為PEF處理前的微生物數(shù)，CFU/mL。

培養(yǎng)基選用YPD固體培養(yǎng)基，NaCl的濃度為0%，即非選擇性培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

1.2.5 PEF處理對(duì)釀酒酵母菌亞致死率的影響

之前的研究中已經(jīng)有通過(guò)非選擇性和選擇性瓊脂培養(yǎng)基對(duì)非熱殺菌處理后的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)對(duì)微生物的損傷程度進(jìn)行評(píng)估的實(shí)驗(yàn)[8］。Perni等[9］通過(guò)向培養(yǎng)基中加入2種不同濃度的NaCl對(duì)PEF作用下大腸桿菌和鼠傷寒桿菌分別進(jìn)行培養(yǎng)，找到了兩種菌的臨界滲透壓并對(duì)亞致死細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了檢測(cè)，Hyun-Gyun Yuk等[10］采用同樣的方法研究了超高壓CO2對(duì)于蘋(píng)果酒中乳酸桿菌的亞致死損傷效果。向培養(yǎng)基中添加一定濃度的NaCl形成適當(dāng)滲透壓對(duì)非熱處理后的微生物進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)已成為亞致死微生物檢測(cè)的一種有效手段。

本文通過(guò)向YPD固體培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl作為選擇性培養(yǎng)基對(duì)PEF處理前后酵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以找到亞致死酵母的臨界滲透壓，NaCl的濃度梯度選擇2%、3%、4%、5%，30℃下培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。亞致死率計(jì)算公式:

式中，N’:PEF處理后的選擇性培養(yǎng)基中微生物數(shù)，CFU/mL;N0:PEF處理前的微生物數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEF不同處理時(shí)間對(duì)釀酒酵母的致死率影響

圖1為PEF不同處理時(shí)間對(duì)PBS緩沖液體系中釀酒酵母致死率的影響。釀酒酵母的致死率是處理時(shí)間的函數(shù)，隨著處理時(shí)間的增加而愈加顯著，當(dāng)處理時(shí)間由100 μs上升至500 μs，電場(chǎng)強(qiáng)度為30 kV/cm時(shí)，PBS緩沖體系中的釀酒酵母菌落數(shù)下降了3.3個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖1 不同處理時(shí)間對(duì)釀酒酵母細(xì)胞致死率的影響

在特定的環(huán)境條件下，數(shù)學(xué)模型已成為描述和預(yù)測(cè)食源性微生物的生長(zhǎng)、存活以及滅活反應(yīng)的重要工具[11］。由圖1可知，PEF對(duì)釀酒酵母的致死作用較好地符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(R2＞0.97)，30 kV/cm場(chǎng)強(qiáng)作用下PEF對(duì)釀酒酵母的殺菌動(dòng)力學(xué)常數(shù)K為6.3×10-3(1/μs)。這與Marsellés-Fontanet等[11］研究的酵母細(xì)胞在橘汁中的殺滅動(dòng)力學(xué)結(jié)果較為接近。

2.2 PEF不同處理時(shí)間對(duì)釀酒酵母的亞致死率影響

本實(shí)驗(yàn)選用的幾種NaCl濃度下釀酒酵母的亞致死率隨處理時(shí)間的變化趨勢(shì)與致死率基本一致，且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處PEF對(duì)于酵母細(xì)胞的亞致死率均高于致死率，證明PEF處理后有亞致死酵母細(xì)胞的存在。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到4%時(shí)，30 kV/cm場(chǎng)強(qiáng)作用下PEF對(duì)釀酒酵母的亞致死殺菌動(dòng)力學(xué)常數(shù)為8.2×10-3(1/μs)，較其他兩組相比顯著高于未添加NaCl組的致死殺菌動(dòng)力學(xué)常數(shù)6.3×10-3(1/μs)。NaCl濃度為5%時(shí)，平板中菌落數(shù)過(guò)小無(wú)法計(jì)數(shù)，即4%NaCl濃度為釀酒酵母細(xì)胞的臨界滲透壓，綜合考慮可采用4%NaCl濃度的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行PEF處理后亞致死釀酒酵母亞致死細(xì)胞數(shù)量的監(jiān)測(cè)。

圖2 PEF在不同NaCl濃度下對(duì)釀酒酵母的亞致死殺菌動(dòng)力學(xué)

由添加NaCl濃度為4%的選擇性培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h后菌落計(jì)數(shù)情況可知，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到500 μs時(shí)，酵母的亞致死率達(dá)到了4.5個(gè)數(shù)量級(jí)，此時(shí)PEF對(duì)釀酒酵母的亞致死作用也較好的符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型(R2＞0.97)。不同時(shí)間強(qiáng)度的PEF處理?xiàng)l件下均有亞致死細(xì)胞產(chǎn)生，并且亞致死細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)量與PEF處理強(qiáng)度正相關(guān)。

2.3 PEF不同處理時(shí)間對(duì)釀酒酵母的亞致死量影響

亞致死細(xì)胞的數(shù)量在一定程度上可以通過(guò)選擇性培養(yǎng)基與非選擇性培養(yǎng)基計(jì)數(shù)的差值估算。亞致死細(xì)胞只有在低NaCl濃度下才能修復(fù)，其數(shù)量增加的速度遠(yuǎn)大于總修復(fù)量[9］。經(jīng)過(guò)同一場(chǎng)強(qiáng)下不同時(shí)間PEF處理后，樣品酵母細(xì)胞中的亞致死細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)(圖3)，釀酒酵母經(jīng)PEF處理后產(chǎn)生了1個(gè)對(duì)數(shù)的亞致死細(xì)胞，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到500 μs時(shí)，酵母亞致死細(xì)胞的數(shù)量達(dá)到了1.5個(gè)對(duì)數(shù)，證明PEF對(duì)酵母細(xì)胞的傷害是經(jīng)過(guò)一定程度的積累造成的，且酵母細(xì)胞損傷的程度大于其修復(fù)的程度。

圖3 不同處理時(shí)間對(duì)釀酒酵母細(xì)胞亞致死細(xì)胞數(shù)量的影響

PEF對(duì)微生物的作用機(jī)制目前尚不完全清楚，關(guān)于脈沖電場(chǎng)殺菌機(jī)理的解釋?zhuān)藗兲岢隽硕喾N學(xué)說(shuō)，其中以“細(xì)胞膜的電穿孔”和“細(xì)胞膜的電崩潰”這兩種模型被廣泛接受。其中“電穿孔”模型即細(xì)胞膜是脈沖電場(chǎng)作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，瞬間高壓脈沖電場(chǎng)可作用于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層，在細(xì)胞膜上形成小孔使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，胞內(nèi)物質(zhì)外溢導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2-3］。García等[13］和Perni等[9］報(bào)道，PEF對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的致死作用是由于PEF對(duì)微生物細(xì)胞的損傷積累所致。PEF處理后會(huì)產(chǎn)生亞致死微生物已被證實(shí)，目前對(duì)于亞致死細(xì)胞的檢測(cè)主要有兩種手段，其一是通過(guò)流式細(xì)胞儀結(jié)合熒光染色技術(shù)對(duì)亞致死細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[14］，其二就是本文中用到的通過(guò)找到亞致死細(xì)胞的臨界滲透壓進(jìn)行選擇性培養(yǎng)以確定其產(chǎn)生數(shù)量。亞致死微生物在適當(dāng)環(huán)境下可自行修復(fù)，會(huì)對(duì)食品安全及貨架期產(chǎn)生威脅，其進(jìn)一步滅菌是提高PEF殺菌效果、延長(zhǎng)PEF非熱殺菌產(chǎn)品貨架期的重要手段。

3 結(jié)論

(1)經(jīng)過(guò)對(duì)釀酒酵母亞致死細(xì)胞不同滲透壓條件下培養(yǎng)后確定其臨界滲透壓條件為4%NaCl。

(2)經(jīng)30 kV/cm場(chǎng)強(qiáng)下循環(huán)處理500 μs后，酵母細(xì)胞的致死量可達(dá)到3.3個(gè)對(duì)數(shù)，亞致死量可達(dá)4.5個(gè)對(duì)數(shù)，PEF對(duì)釀酒酵母致死作用及亞致死作用的殺菌動(dòng)力學(xué)常數(shù)均較好的符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，一定處理強(qiáng)度下可產(chǎn)生1.5個(gè)對(duì)數(shù)的亞致死酵母細(xì)胞。

(3)亞致死細(xì)胞數(shù)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，PEF對(duì)酵母細(xì)胞的致死作用是經(jīng)過(guò)逐漸的損傷積累造成的。

[1]趙偉，楊瑞金.高壓脈沖電場(chǎng)對(duì)食品中微生物、酶及組分影響的研究進(jìn)展[J］.食品與機(jī)械，2010，26(3):153-157.

[2]Min S，Jin ZT，Zhang QH.Commercial scale pulsed electric field processing of tomato juice[J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51(11):3338-3344.

[3]Evrendilek GA.Inactivation kinetics of pathogenic microorganisms by pulsed electric fields[D］.The Ohio State University，2002.

[4]Zou Tiejun，Liu Xiang，Ding Shangshu，et al.Evaluation of sperm mitochondrial function using rh123/PI dual fluorescent staining in asthenospermia and oligoasthenozoospermia[J］.Journal of Biomedical Research，2010，24(5):404-410.

[5]Ritz M，Tholozan J L，F(xiàn)ederighi M，et al.Morphologicaland Physiological Characterization of Listeria monocytogenes Subjected to High Hydrostatic Pressure[J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(5):2240-2247.

[6]Christine E R Dodd.Suicide through stress:A bacterial response to sub-lethal injury in the food environment[J］.International Journal of Food Microbiology，2007，120(1-2):46-50.

[7]Somolinos M，Ma?as P，Condón S，et al.Recovery of Saccharomyces cerevisiae sublethally injured cells after Pulsed Electric Fields[J］.International Journal of Food Microbiology，2008，125(3):352-356.

[8]Kalchayanand N，Sikes A，Dunne C P，et al.Factors influencing death and injury of foodborne pathogens by hydrostatic pressure-pasteurization[J］.Food Microbiology，1998，15(2):207-214.

[9]Perni S，Chalise P R，Shama G，et al.Bacterial cells exposed to nanosecond pulsed electric fields show lethal and sublethal effects[J］.International Journal of Food Microbiology，2007，120(3):311-314.

[10]Hyun-Gyun Yuk，David J Geveke.Nonthermal inactivation and sublethal injury of Lactobacillus plantarum in apple cider by a pilot plant scale continuous supercritical carbon dioxide system[J］.Food Microbiology，2011，28(3):377-383.

[11]Jonathan Mosqueda-melgar，Pedro elez-mart＇inez，Effects of Pulsed Electric Fields on Pathogenic Microorganisms of Major Concern in Fluid Foods:A Review[J］.Food Science and Nutrition，2008，48(8):747-759.

[12]á Robert Marsellés-Fontanet，Anna Puig，Paola Olmos，et al.Optimising the inactivation of grape juice spoilage organisms by pulse electric fields[J］.International Journal of Food Microbiology，2009，130(3):159-165.

[13]García D，Man?s P，Gómez N，et.al.Biosynthetic requirements for the repair of sublethal membrane damage in Escherichia coli cells after pulsed electric fields[J］.Journal of Applied Microbiology，2006，100(3):428-435.

[14]Skowronek P，Krummeck G，Haferkamp O，et al.Flow cytometry as a tool to discriminate respiratory competent and respiratory-deficient yeast cells[J］.Current genetics，1990，18(3):265-267.

ABSTRACTTo explore the sterilization mechanism of Saccharomyces cerevisiae caused by pulsed electric field(PEF)，the existence and production patterns of sub-lethal yeast cells under PEF treatment were revealed.Using phosphate buffer(PBS)at pH7.2 as model system，S.cerevisiae cells were processed under 30kV/cm electric field strength from 100μs to 500μs.Sub-lethal S.cerevisiae cells were counted respectively after incubation in selective medium and non-selective medium.The results showed that the critical osmotic pressure of sub-lethal S.cerevisiae were 4%NaCl.After PEF treatment，S.cerevisiae became to be sub-lethal with reductions to 4.5 Log units，and the number of sub-lethal cell were 1.5 Log，and the degree of sub-lethal increased with the treatment time increased.Selective medium can be used in quantitative detection of sub-lethal cells during PEF treatment.

Key wordspulsed electric field(PEF)，Saccharomyces cerevisiae，sub-lethal cells，selective medium

Existence and Detection of Sub-lethal S.cerevisiae Cells Under Pulsed Electric Field Treatment

Gu Yan-jie1，Zhao Wei2，Yang Rui-jin2，Yan Wen1
1(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(State Key Laboratory of Food Science＆Technology and School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(楊瑞金教授為通訊作者，E-mail:yrj@jiangnan.edu.cn)。

*國(guó)家自然科學(xué)基金(31000829);國(guó)家“十二五”863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100801-02);江蘇省自然科學(xué)基金(BK2010148)

2012-03-27，改回日期:2012-05-21