黏質(zhì)沙雷氏菌胞外幾丁質(zhì)酶的純化及特性

施騰鑫，黃秀菁，劉嘉，賀淹才

1(福建福大百特科技發(fā)展有限公司酶高效表達(dá)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州，350000)

2(華僑大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)研究所，福建泉州，362021)

黏質(zhì)沙雷氏菌胞外幾丁質(zhì)酶的純化及特性

施騰鑫1，黃秀菁1，劉嘉2，賀淹才2

1(福建福大百特科技發(fā)展有限公司酶高效表達(dá)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州，350000)

2(華僑大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)研究所，福建泉州，362021)

黏質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、DEAE-瓊脂糖凝膠陰離子交換層析和苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析，得到電泳純的幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白CBP21。該幾丁質(zhì)酶和CBP21分子質(zhì)量分別約為58 ku和21 ku，CBP21對(duì)該幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)增效明顯。幾丁質(zhì)酶反應(yīng)最適溫度為50℃，最適pH約為6.5～7.0。該酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。酶的Km值為0.22 mg/mL，Vm為1.26 μmol/(min·mg)。金屬離子K+、Sn2+、Mn2+對(duì)酶有一定激活作用，而Pb2+、Hg2+和Cu2+則強(qiáng)烈抑制其活性。該幾丁質(zhì)酶的糖基含量約為3.3%。EDTA和2-ME可分別提高酶活力65%和105%。H2O2強(qiáng)烈抑制酶活力，提示其活性中心可能存在硫氫基。

黏質(zhì)沙雷氏菌，幾丁質(zhì)酶，純化，特性

幾丁質(zhì)(又稱甲殼素)是N-乙酰-D-葡萄糖胺以2-1，4糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，是自然界中含量?jī)H次于纖維素的可再生資源[1］。幾丁質(zhì)酶(Chitinase，EC3.4.1.14)分布廣泛，幾乎從微生物到高等動(dòng)植物所有的生物類群中都有分布[2］，其中產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物種類涵蓋了細(xì)菌、放線菌和霉菌。但目前對(duì)幾丁質(zhì)純品酶的研究報(bào)道尚少，已報(bào)道的得到純化的胞外幾丁質(zhì)酶有綠色木霉、鏈霉菌、球孢白僵菌、產(chǎn)氣腸桿菌、黃桿菌等[3-7］，而且?guī)缀跛袑?duì)幾丁質(zhì)酶的純化及特性的研究均集中于單酶，而未對(duì)酶或蛋白間的協(xié)同作用加以研究分析。在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中，很多酶在降解底物上的協(xié)同作用極為明顯，如纖維素酶[8］、阿魏酸酯酶[9］等，而針對(duì)幾丁質(zhì)酶在這方面的報(bào)道卻較為罕見。因此本研究對(duì)1株黏質(zhì)沙雷氏菌所產(chǎn)的胞外幾丁質(zhì)酶進(jìn)行純化，得到電泳純幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP21)，初步對(duì)該幾丁質(zhì)酶和CBP21的協(xié)同作用進(jìn)行了研究，并對(duì)該幾丁質(zhì)酶的一系列特性進(jìn)行分析探討，對(duì)了解其結(jié)構(gòu)和功能具有積極意義，為后續(xù)工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)分離自海灘土壤，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 SMCS 培 養(yǎng)基[10］

K2HPO4700 mg，KH2PO4300 mg，NaCl 300 mg，MgSO4·7H2O 500 mg，CaCl2300 mg，ZnSO410 mg，CoCl210 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg，膠體幾丁質(zhì)10 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0～7.1。每250 mL三角瓶裝量50 mL，8層紗布扎口。

1.3 主要試劑及儀器

幾丁質(zhì)、考馬斯亮藍(lán)R250、SDS、Glycin和TEMED等購(gòu)自Sigma公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為Takara公司產(chǎn)品;EDTA(乙二胺四乙酸)、DEPC(二乙基焦碳酸鹽)、PMSF(苯甲基磺酰氟)、乙二醛(Glyoxal)、Ch-T(氯胺-T)、2-ME(β-巰基乙醇)均購(gòu)自Sigma公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

AKTA快速液相層析儀，GE;DEAE-Sepharose FF和Phenyl-Sepharose FF，Pharmacia;垂直板狀電泳槽，Bio-Rad;高速冷凍離心機(jī)，Sigma;凝膠成像系統(tǒng)，上海天呈科技有限公司。

1.5 分析方法

1.5.1 幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定

參照Nawani法[11］，0.5 mL膠體幾丁質(zhì)與適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL于50℃水浴振蕩反應(yīng)1 h，用DNS法[12］測(cè)定。酶活力單位(U)定義為:在50℃下每分鐘釋放出相當(dāng)于1 μmol N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的還原糖所需要的酶量。

1.5.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用改進(jìn)的Bradford法[13］。取100 μL樣品液，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)，30℃靜置20 min后，于590nm和450 nm處分別測(cè)定吸光度值，以O(shè)D590/OD450為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)。

1.5.3 電泳

采用垂直板狀電泳，SDS-PAGE按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[14］。

1.6 純化步驟

分離純化過程所用緩沖液均為pH 7.0、0.02 mol/L的Tris-HCl緩沖液;冷凍離心條件均為4℃，8000 r/min，15 min。

1.6.1 硫酸銨鹽析

將培養(yǎng)液于冷凍離心，所得上清液即為粗酶液。70%飽和度硫酸銨沉淀，4℃靜置過夜。冷凍離心棄上清，沉淀溶解于緩沖液中，100倍體積于相同體系中透析48 h除鹽，每12 h更換1次緩沖液。

1.6.2 DEAE瓊脂糖凝膠陰離子交換層析

離子交換柱為DEAE-瓊脂糖凝膠柱(1 mL)。將上清液加到瓊脂糖凝膠離子交換柱，用含有0～0.5 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫(pH7.2，流速1 mL/min)。

1.6.3 苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析

疏水層析柱為苯基-瓊脂糖凝膠柱(1 mL)。將活力組分冷凍干燥濃縮后，加硫酸銨至終濃度為1mol/L上苯基-瓊脂糖凝膠疏水柱，用不含硫酸銨和含1 mol/L硫酸銨的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫(流速1 mL/min)。

1.7 酶學(xué)特性

1.7.1 表觀相對(duì)分子量的測(cè)定

SDS-PAGE法測(cè)定相對(duì)分子量。

1.7.2 幾丁質(zhì)酶與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的協(xié)同性

將純化得到的幾丁質(zhì)酶與CBP21以一定比例混合，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力。以不含CBP21的酶液作為對(duì)照，研究幾丁質(zhì)酶和CBP21對(duì)底物作用的協(xié)同性。

1.7.3 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

在不同溫度下按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活，以酶活最高者為100%。酶液在30～80℃下保溫不同時(shí)間后，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)殘余酶相對(duì)活力，以未保溫的酶液的酶活力為100%。

1.7.4 酶的最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性

將酶液分別加在pH3.0～10.0的緩沖液中，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以酶活最高者為100%。將酶液用不同pH的緩沖液稀釋，50℃保溫1 h后，測(cè)殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力100%。

1.7.5 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

將酶液與不同濃度的幾丁質(zhì)反應(yīng)后測(cè)定其酶活力。用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求出該酶的Km及Vm值[12］。

1.7.6 金屬離子對(duì)酶活力的影響

用0.1mol/L的 Na2HPO4-檸 檬 酸 緩 沖 液(pH6.5)配制含5 mmol/L的金屬離子緩沖液，與0.5 mL酶液50℃和1%膠體幾丁質(zhì)混勻，50℃反應(yīng)1h后測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，以不含金屬離子的反應(yīng)液為對(duì)照。

1.7.7 底物特異性

在反應(yīng)體系中以不同底物進(jìn)行幾丁質(zhì)酶的酶解反應(yīng)，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力。

1.7.8 修飾實(shí)驗(yàn)

加入不同濃度的蛋白修飾劑于酶液中，調(diào)整至所需的終濃度，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力。

1.7.9 糖基含量測(cè)定

采用乙酸乙酯-蒽酮-濃硫酸法[15-16］測(cè)定。利用由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖等10種糖配制成混合糖溶液獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。將酶液按要求加入一定量的乙酸乙酯-蒽酮混合液及濃硫酸，室溫反應(yīng)30 min后于620 nm比色測(cè)定，結(jié)合糖基含量標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算得出糖基含量(w/w)。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶的分離純化

2.1.1 DEAE-瓊脂糖凝膠陰離子交換層析

黏質(zhì)沙雷氏菌在SMCS培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)3天后，發(fā)酵液冷凍離心后通過硫酸銨沉淀、透析及DEAE瓊脂糖凝膠離子交換層析，得到圖1。有3個(gè)吸收峰，峰1的幾丁質(zhì)酶活力高蛋白集中，收集峰1處的活性組分進(jìn)行電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有2條蛋白帶。將收集到的組分濃縮后上苯基-瓊脂糖凝膠疏水柱。

2.1.2 苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析

經(jīng)離子交換層析后得到的樣品上疏水柱后，用不含硫酸銨和含1 mol/L硫酸銨的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫圖譜見圖2。在純化過程中出現(xiàn)2個(gè)蛋白峰。通過酶活力測(cè)定，幾丁質(zhì)酶活力集中在峰2。收集峰2處活性液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。純化結(jié)果見表1。

圖2 苯基-瓊脂糖凝膠疏水柱層析圖

2.1.3 酶純度鑒定及實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

SDS-PAGE結(jié)果如圖3所示，經(jīng)鹽析、DEAE-瓊脂糖凝膠離子交換層析和苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析后所得的幾丁質(zhì)酶已達(dá)電泳純。該酶分子質(zhì)量為58 ku。此外，對(duì)疏水層析中收集到的峰1的蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE，亦呈單一條帶，分子質(zhì)量為21 ku。該蛋白無酶活性;將其與膠體幾丁質(zhì)混合于4℃下靜置1h后離心，得到的上清中幾乎不存在蛋白，表明該蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合力強(qiáng);將該蛋白與純化的幾丁質(zhì)酶混合，發(fā)現(xiàn)其對(duì)酶解幾丁質(zhì)有增效作用。這些特征與Kazushi等人[17］的研究結(jié)果一致。將幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白和幾丁質(zhì)酶根據(jù)Brurberg的報(bào)道[18］進(jìn)行對(duì)比，該幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白可能分別為ChiA和CBP21。

圖3 幾丁質(zhì)酶SDS-PAGE電泳圖譜

2.1.4 純化結(jié)果

分別測(cè)定純化各步驟的酶活力和蛋白量，求出純化后的比活力、產(chǎn)率以及純化倍數(shù)，純化結(jié)果詳見表1。發(fā)酵液經(jīng)鹽析、DEAE-瓊脂糖凝膠離子交換層析和苯基-瓊脂糖凝膠疏水層析后，得到純酶，比活力由粗酶液的43.07 U/mg提高到純酶液的1575.76 U/mg，純化36.6倍，收率8.5%。但在純化過程中，隨著蛋白樣品組分中的抑制成分或促進(jìn)成分的逐步移除，酶的活力會(huì)得到較大的提升或降低。因此對(duì)于某些酶樣品，根據(jù)比活力來推算純化倍數(shù)和收率的方法，只能作為粗略方案[19］。

表1 幾丁質(zhì)酶純化過程

2.2 酶學(xué)特性

2.2.1 幾丁質(zhì)酶與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的協(xié)同性

將幾丁質(zhì)酶與CBP21以不同比例混合后測(cè)定酶活力，研究二者對(duì)底物作用的協(xié)同性，結(jié)果見圖4。隨著CBP21的濃度的比率的增加，幾丁質(zhì)酶水解效果顯著增強(qiáng)，相對(duì)酶活力最高可達(dá)365%。這可能由于CBP21首先與底物結(jié)合，從而使底物呈現(xiàn)出易于被幾丁質(zhì)酶水解的構(gòu)象[20］，從而提高了酶的水解效率。

圖4 幾丁質(zhì)酶與CBP21水解膠體幾丁質(zhì)的協(xié)同性

2.2.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性

在不同溫度下測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，并將幾丁質(zhì)酶分別保溫1 h后，測(cè)定殘留酶活力，結(jié)果見圖5。在30℃～50℃之間，隨著反應(yīng)溫度的升高，水解效率顯著增加，50℃為酶反應(yīng)最佳溫度，55℃時(shí)酶活力約下降50%，70℃時(shí)酶基本失活。將酶液保溫1h后按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，酶在30～55℃較為穩(wěn)定，溫度大于55℃時(shí)酶活力迅速下降，超過65℃酶基本失活。

2.2.3 最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性

圖5 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響及熱穩(wěn)定性

在不同pH值的緩沖液體系中測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，并將幾丁質(zhì)酶在不同pH的體系中放置1h后測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖6。pH 4.5～6.5時(shí)，相對(duì)酶活力在75%以上，pH 6.5左右時(shí)酶活力最高。當(dāng)pH為10.0時(shí)，該幾丁質(zhì)酶活力仍能保持50%以上。在不同pH環(huán)境下放置1 h后測(cè)定殘余酶活力發(fā)現(xiàn)，該酶在pH4.5～8.0，可以保持原來酶活力的50%以上，當(dāng)pH低于4.5或高于8.0時(shí)酶活力迅速喪失。

2.2.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

將膠體幾丁質(zhì)溶于Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0.02 mol/L，pH 6.5)中，配成0.2～10.0 mg/mL濃度，以相同酶濃度進(jìn)行反應(yīng)。由Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算米氏常數(shù)，該酶的Km和Vm值分別為0.22 mg/mL和1.26 μmol/(min·mg)。

圖6 pH對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響及酸堿穩(wěn)定性

圖7 黏質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶的Lineweaver-Burk圖

2.2.5 金屬離子對(duì)酶活力影響

在反應(yīng)體系中加入不同金屬離子，使其終濃度為5 mmol后，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，結(jié)果見表2。金屬離子K+、Sn2+、Mn2+對(duì)幾丁質(zhì)酶酶活性有一定激活作用，而Pb2+、Cu2+和Hg2+則強(qiáng)烈抑制該幾丁質(zhì)酶活性，其中更以Hg2+抑制作用最強(qiáng)。

表2 不同金屬離子對(duì)酶活力的影響

2.2.6 幾丁質(zhì)酶的底物特異性

分別以膠體幾丁質(zhì)、水溶性殼聚糖、微晶纖維素、羧甲基纖維素和天然蝦殼粉(過60目篩)為底物測(cè)定酶活力，底物濃度均為1%，結(jié)果如圖8所示。該幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)具有較高的底物特異性，對(duì)天然蝦殼粉的降解能力也較好。此外，該酶還有一定的殼聚糖酶活性。

2.2.7 酶的蛋白修飾

圖8 幾丁質(zhì)酶的底物特異性

在反應(yīng)體系中加入一定量的蛋白修飾劑，調(diào)整至所需的終濃度(0.3%，0.5%，0.8%，1.0%，1.5%，v/v或w/v)，測(cè)定幾丁質(zhì)酶活力，結(jié)果如圖9所示。結(jié)果表明，在所示的濃度下，DEPC對(duì)該幾丁質(zhì)酶有輕微的激活作用。EDTA和2-ME顯著提高酶活力，最高促進(jìn)率分別可分別提高65%和105%，表明該酶為非金屬酶，活性中心不存在二硫鍵;PMSF和DEPC對(duì)酶活力沒有明顯影響，說明酶的活性中心不存在絲氨酸和組氨酸;H2O2強(qiáng)烈抑制酶活性，此外該酶也被Hg2+強(qiáng)烈抑制，說明該幾丁質(zhì)酶對(duì)氧化劑極為敏感，提示其活性中心可能存在硫氫基;CH-T和乙二醛使酶發(fā)生了一定程度的鈍化，可能是由于CHT和乙二醛修飾了該酶活性中心以外的蛋氨酸殘基和精氨酸殘基而間接導(dǎo)致酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變。

圖9 不同修飾劑對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

2.2.8 糖基含量測(cè)定

將純化得到的純酶采用乙酸乙酯-蒽酮-濃硫酸法對(duì)糖基含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得糖基含量約為3.3%。多數(shù)真菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的糖基含量較高，使得該酶顯著區(qū)別于真菌幾丁質(zhì)酶。

3 結(jié)論

幾丁質(zhì)酶是一類差異較大的水解酶類，一些文獻(xiàn)已報(bào)道了不同來源的幾丁質(zhì)酶的分離純化及性質(zhì)研究[4-7］。本文在幾丁質(zhì)酶的相對(duì)分子量、反應(yīng)溫度、耐酸堿性以及金屬離子對(duì)酶活力的影響等方面進(jìn)行了研究，與已報(bào)道純化的黏質(zhì)沙雷氏菌胞外酶[21］相比較差異較為顯著。此外，本文還對(duì)幾丁質(zhì)酶與幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(CBP21)的協(xié)同作用、底物特異性、活性中心基團(tuán)以及糖基含量方面作了研究。結(jié)果表明，CBP21對(duì)該幾丁質(zhì)酶有顯著增效作用，可使該酶對(duì)底物的催化效率提高365%;該幾丁質(zhì)酶的糖基含量低，酶活力可被EDTA和2-ME試劑顯著提高等特性使得該酶顯著區(qū)別于一些真菌幾丁質(zhì)酶[22-24］;該幾丁質(zhì)酶對(duì)天然蝦殼粉的作用效果較好，表明該酶在實(shí)際應(yīng)用中有著較好的應(yīng)用價(jià)值。

在純化過程的離子交換步驟中的第2個(gè)洗脫峰的蛋白液也存在酶活力。通過SDS-PAGE檢驗(yàn)，其目的條帶與主峰不同，應(yīng)屬于不同的幾丁質(zhì)酶，但由于酶活力低蛋白含量較少，故未予收集。因此，為了研究不同幾丁質(zhì)酶之間的協(xié)同作用，應(yīng)構(gòu)建含不同幾丁質(zhì)酶基因的工程菌以純化出相應(yīng)的幾丁質(zhì)酶，研究其對(duì)幾丁質(zhì)的水解機(jī)理以及協(xié)同增效的最適配比，為提高幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性而進(jìn)行的固定化混合酶研究工作研究奠定基礎(chǔ)。

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ABSTRACTAn extracellular chitinase and a chitin-binding protein(CBP21)were isolated from the culture of Serratia marcescens and purified to electrophoretic homogeneity by ordinal procedures containing ammonium sulfate precipitation，DEAE-Sepharose and Phenyl-Sepharose chromatography.Their relative molecular masses were estimated to be respectively about 58kD and 21kD by SDS-PAGE.CBP21 had great synergistic effect with the chitinase on chitin hydrolysis.The optimum temperature and pH for the enzyme activity were 50℃and 6.5 respectively.The enzyme activity was stable under 55℃and in the pH range of 4.5～8.0.Michaelis constants of the enzyme were Km 0.22 mg/mL and Vm 1.26 μmol/(min·mg)respectively.The activity was enhanced by K+，Sn2+and Mn2+and was strongly inhibited by Pb2+，Hg2+and Cu2+.EDTA and 2-mercaptoethanol(2-ME)enhanced the activity by 65%and 105%respectively.H2O2strongly inhibited chitinase activity，which indicated that hydrosulfide group was the possible essential residue for enzyme activity.

Key wordsSerratia marcescens，chitinase，purification，characterization

Purification and Characterization of Extracellular Chitinase from Serratia marcescens

Shi Teng-xi1，Huan Xiu-jing1，Liu Jia2，He Yan-cai2
1(National Engineering Laboratory for High Effective Enzyme Express in Fujian Fuda Biotech，Ltd.，F(xiàn)uzhou 350002，China)
2(Institute of Industrial Biotechnology，Huaqiao University，Quangzhou 362021，China)

碩士，(賀淹才教授為通訊作者)。

2012-03-05，改回日期:2012-05-20