酸酶水解-HPLC法檢測香菇多糖中β-D-葡聚糖含量*

于雅娟，戴軍，朱松，陳尚衛，江波

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

酸酶水解-HPLC法檢測香菇多糖中β-D-葡聚糖含量*

于雅娟，戴軍，朱松，陳尚衛，江波

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

為了更有效地監控食品和醫藥行業中香菇多糖制品的質量，建立了一種香菇多糖中主要活性成分β-D-葡聚糖含量測定的新方法:香菇多糖樣品經酸部分水解后用β-1，3-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶進一步完全水解以測定總葡聚糖含量;另用淀粉葡萄糖苷酶水解樣品中α-葡聚糖;根據HPLC測定的總葡聚糖與α-葡聚糖含量之差計得β-D-葡聚糖含量。分別用該方法和苯酚硫酸法及剛果紅法測定已知含量的β-D-葡聚糖對照樣品的結果表明:該方法最接近于對照品標示值，且重復性好，可用作為香菇多糖產品中β-D-葡聚糖含量測定的專屬方法。

香菇多糖，β-D-葡聚糖，酸酶水解，HPLC

香菇多糖是一種以β-(1，3)-D葡萄糖殘基為主鏈，側鏈為β-(1，6)-D葡萄糖殘基的葡聚糖，其中每5個β-(1，3)-D-Glc就有2個β-(1，6)-D-Glc。香菇多糖的免疫調節、抗腫瘤、抗病毒等功能和幾乎無毒副作用的優點已得到學術界的公認，并已經作為一種輔助治療腫瘤的藥物應用于臨床，或作為免疫增強劑用于保健食品中。藥理研究結果表明，香菇多糖的主要抗癌活性成分是β-D-葡聚糖[1-2］，其含量的高低是表征香菇多糖產品質量的主要指標之一。然而目前食品或藥品企業使用的香菇多糖產品檢測方法是蒽酮比色法或苯酚硫酸法(NY/T 1676—2008，食用菌中粗多糖含量的測定，農業行業標準)，主要檢測總多糖含量，沒有專屬性。關于香菇多糖中的β-D-葡聚糖的檢測方法尚無文獻報道。針對啤酒中β-D-葡聚糖的含量測定，文獻中大多采用剛果紅法[3］。

本文根據香菇多糖產品的組成特點，建立了一種香菇多糖產品中β-D-葡聚糖含量測定的新方法，即將香菇多糖部分酸水解后用β-1，3-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶進一步完全水解用于測定香菇多糖中的總葡聚糖含量，用淀粉葡糖苷酶水解香菇多糖中的α-葡聚糖，根據HPLC測定的總葡聚糖含量與α-葡聚糖含量之差，計得β-D-葡聚糖含量;并以已知含量的β-D-葡聚糖對照品為樣品，分別用本方法和苯酚硫酸法及剛果紅法進行檢測和比較，以驗證3種方法的適用性。

1 實驗材料與試劑

1.1 儀器與試劑

Waters 600高效液相色譜儀，配2410示差折光檢測器;7200型分光光度計(美國UNICO尤尼柯限公司);D-葡萄糖(Glc，99%，國藥集團化學試劑有限公司);酵母β-葡聚糖對照品(純度53%，美國Sigma-Aldrich公司);昆布多糖對照品(純度30%，美國Sigma-Aldrich公司);熱凝膠多糖(Curdlan，純度99%，美國Sigma-Aldrich公司);β-(1，3)-葡聚糖外切酶(E.C.3.2.1.58，100000 U/L)，購于上海中西遠大科技有限公司;β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21，20，000 U/L)購于上海佳和生物科技有限公司;淀粉葡糖苷酶(EC 3.2.1.3，1，630，000 U/L)，購于南昌瑞洋科技發展有限公司。苯酚、硫酸、剛果紅等其他試劑均為分析純。

葡萄糖標準溶液:準確稱取2 g(精確至0.0001 g)經過干燥至恒重的D-葡萄糖，用超純水定容于100 mL容量瓶中，配制成20 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

6%苯酚溶液:取苯酚100 g，鋁片0.01 g和NaHCO30.05 g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取上述處理過的苯酚5 g，加蒸餾水定容至100 mL。

剛果紅溶液:取25 mg剛果紅，加入0.2 mol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液，定容至250 mL。

1.2 色譜條件

色譜柱:Spherisorb NH2色譜柱(0.46 cm×25 cm，7μm);流動相:乙腈/水(7/3，體積比);流速:1 mL/min;檢測器:示差折光檢測器。

2 實驗方法

2.1 酸酶法

2.1.1 葡聚糖完全水解

分別準確稱取100 mg左右香菇多糖及酵母β-葡聚糖、熱凝膠多糖、昆布多糖3個β-D-葡聚糖對照樣品至具塞試管中，加入1.5 mL濃HCl(37%，v/v)，混勻。在30℃下水浴45 min。水浴期間每隔15 min渦旋混勻1次，以確保所有的β-葡聚糖溶解。稀釋HCl至1.3 mol/L，渦旋混勻，置于沸水浴中，反應2 h。反應完后將試管冷卻至室溫，加入2 mol/L KOH，直至pH 5.0。定量轉移管中的內容物至100 mL容量瓶，用200 mmol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖液漂洗試管，并合并于容量瓶中，再定容、過濾。取0.1 mL濾液，加0.1 mL用200 mmol/L pH 5.0醋酸鈉緩沖液稀釋的β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡糖苷酶液，旋渦混勻，40℃反應1 h，得到酶解液1。

2.1.2 酶解 α-葡聚糖

分別準確稱取100 mg左右香菇多糖及酵母β-葡聚糖、熱凝膠多糖、昆布多糖3個β-D-葡聚糖對照樣品至具塞試管中，加入2 mL2mol/L的KOH，再將試管在冰浴狀態下磁力攪拌20 min。向試管中加8 mL的1.2 mol/L pH 3.8醋酸鈉緩沖液，磁力攪拌以混勻溶液。立即加入0.2 mL溶于50%甘油的淀粉葡糖苷酶液，混勻，40℃下反應30 min，期間間歇漩渦混勻。離心(1500 g)10 min，得到酶解液2。

2.1.3 HPLC測定酶解液中葡萄糖含量

將葡萄糖標準溶液及上述酶解液分別過0.22 μm的濾膜，按1.2進樣分析，以外標法測定葡萄糖含量，并按下列公式計算β-D-葡聚糖含量:

式中X1和X2分別為由酶解液1和酶解液2測得的葡萄糖含量。

2.2 苯酚硫酸法[4］

取葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL到10 mL具塞試管中，分別補水至1.0 mL，混合均勻，加入6%苯酚溶液1.0 mL，混勻，然后迅速垂直滴加5.0 mL H2SO4，立即漩渦混勻。在80℃下反應30 min，靜置冷卻至室溫，于A490nm處測定其吸光值。以葡萄糖含量m(μg)對吸光值A作線性回歸，得標準曲線方程。

分別準確稱取適量香菇多糖樣品及3個β-D-葡聚糖對照品，控制糖含量在10～100 μg內，同標準曲線測定法處理，測其吸光值，并由標準曲線方程計得樣品中葡萄糖含量，再計算樣品中總多糖含量:

式中，C為樣品溶液中葡萄糖的濃度(mg/mL);D為樣品溶液的稀釋倍數;W為相應的樣品質量(mg)。

2.3 剛果紅法[3］

2.3.1 標準曲線

由于沒有香菇多糖標準品，所以選用與香菇多糖結構類似的curdlan[5］作為標準品。精密稱取10 mg curdlan，用0.5 mol/L NaOH溶解，用0.5 mol/L HCl中和至pH 8～9，再定容至100 mL，即得到0.1 mg/mL標準溶液。分別移取其標準溶液0，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL至10 mL具塞試管中，均補水至2.0 mL，混勻，加入pH 8.0的剛果紅溶液4.0 mL，搖勻，然后30℃反應30 min，于550 nm處測定其吸光值。以葡萄糖含量m(μg)對吸光值A作線性回歸，即得標準曲線方程。

2.3.2 樣品中β-D-葡聚糖含量的測定

分別準確稱取一定量香菇多糖樣品及β-D-葡聚糖對照樣品配制成1 mg/mL水溶液，精密吸取0.5 mL至10 mL具塞試管中，補水至2.0 mL，加入4.0 mL剛果紅溶液，混勻，30℃反應30 min，于550 nm處測定其吸光值，并由標準曲線方程計得樣品中葡萄糖含量。計算樣品中β-D-葡聚糖含量:

式中，C為樣品溶液中葡聚糖的濃度(mg/mL);D為樣品溶液的稀釋倍數;W為相應的樣品質量(mg)。

3 結果與討論

3.1 酸酶水解-HPLC法測定原理

β-(1，3)-葡聚糖外切酶來源于木霉菌，該酶的最適反應溫度為40～50℃;最適反應pH在pH 6.0以下[7］。該酶的水解模式是與底物結合后從β-(1，3)-葡聚糖的非還原性末端開始依次切開底物的β-(1，3)-葡萄糖糖苷鍵，釋放單一的葡萄糖。β-葡萄糖苷酶，又稱β-D-葡萄糖苷，存在于自然界許多植物、昆蟲、酵母、曲霉、木霉及細菌體內。它能夠催化水解結合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出D-葡萄糖[8］。淀粉葡糖苷酶，又稱為葡糖淀粉酶，能夠從1，4-α-D-葡聚糖鏈的非還原性末端依次催化水解1，4-α-D-葡糖苷鍵，釋放出α-D-葡萄糖。也能迅速水解與1，4-糖苷鍵鄰接的1，6-α-D-糖苷鍵。

本方法是先將香菇多糖進行部分酸水解，使β-D-葡聚糖降解和非凝膠化且切斷與蛋白或其它多糖的鍵合而溶于水，并使α-葡聚糖完全水解。再用β-(1，3)-葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶把較難酸解的β-葡聚糖完全水解成葡萄糖，然后通過測定釋放的葡萄糖的量計算香菇多糖中的葡聚糖總量。為計算β-D-葡聚糖的含量，需扣除可能含有的少量α-葡聚糖。本方法主要利用淀粉葡糖苷酶將α-葡聚糖水解成葡萄糖，再用HPLC測定之。

3.2 酸酶水解-HPLC法測定結果

用已知含量的昆布多糖，酵母β-葡聚糖對照品以及curdlan作為β-D-葡聚糖對照品，與香菇多糖樣品一起進行酸酶法測定，其中香菇多糖樣品的酶解液1和酶解液2的HPLC譜圖見圖1和圖2，其中保留時間6.32 min是葡萄糖峰。根據外標法計算的結果見表1。由表1可見，該方法測定結果與供試品標示含量很接近。平行樣品(n=3)測定結果的相對標準偏差(RSD)為2.02%～2.94%，重復性很好。結果表明，該方法準確可靠，可以用于香菇多糖中β-D-葡聚糖含量的測定。

圖1 酶解液1的HPLC譜圖

圖2 酶解液2的HPLC譜圖

表1 酸酶水解-HPLC法測定香菇多糖樣品及對照品的β-D-葡聚糖含量(n=3)

3.3 苯酚硫酸法與酸酶法的結果比較

按2.2測得標準曲線的回歸方程為y=0.0090x-0.0020，R2=0.9978。在0～100 μg內，糖含量與吸光值線性關系良好。

分別取2.0 mL經稀釋好的香菇多糖樣品及β-D-葡聚糖對照品，按2.2的方法測定吸光值，平行測定3次，取平均值，通過標準曲線，計算出樣品中多糖含量，結果如表2。

表2 苯酚硫酸法及剛果紅法測定香菇多糖樣品及對照品的葡聚糖含量(n=3)

苯酚硫酸法是多糖含量測定的常用方法，該法測定的是樣品中總糖含量，沒有選擇性，故除Curdlan外結果比酸酶法測定的β-D-葡聚糖含量高許多。其方法缺乏專屬性。

3.4 剛果紅法與酸酶法的結果比較

剛果紅與β-D-葡聚糖的結合具有高度專一性，在一定條件下能夠形成有色物質[9］。剛果紅法多應用于燕麥和啤酒中的β-葡聚糖的含量測定，所用標準品一般為從小麥中提取出的β-葡聚糖標準品。本文選用與香菇多糖結構類似的Curdlan作為標準品，用與樣品溶解相同的方法配制標準溶液，定量測定香菇多糖及β-D-葡聚糖對照品中β-D-葡聚糖的含量。以葡萄糖含量(x)對吸光值(y)作線性回歸得標準曲線方程為y=0.0013x+0.0392，R2=0.9960。香菇多糖樣品及β-D-葡聚糖對照品的測定結果于表2。與酸酶法比較，測定的結果過低，可能是因為對照品中β-D-葡聚糖分子被其他多糖或蛋白等大分子包裹未能充分溶解和絡合，使顯色不足，故該法不適用于測定固態供試品中β-D-葡聚糖含量。

4 結論

β-D-葡聚糖是香菇多糖中主要活性成分，其含量是表征香菇多糖產品質量的主要指標之一。與苯酚硫酸法及剛果紅法比較，本文建立的酸酶水解-HPLC法對于香菇多糖中β-D-葡聚糖的含量測定具有較好專屬性，準確可靠，重復性好，可應用于香菇多糖產品的質量檢測和監控。

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ABSTRACTA new method for determination of β-D-glucans content in Lentinan was developed by acidic and enzymatic hydrolysis coupled with high performance liquid chromatography(HPLC).Lentinan was hydrolyzed entirely to glucose with exo-1，3-β-glucanase and β-Glucosidase after partial acid hydrolysis for determination of total glucans by HPLC.α-Glucans in Lentinan samples were hydrolyzed to glucose with Amyloglucosidase and then also analyzed by HPLC.The content of β-D-glucan was calculated by the difference between total glucans and α-glucans.Moreover，the above method and phenol sulfuric acid method and Congo red method were used respectively to determine the content of glucans(or β-D-glucan)in laminarin，curdlan and yeast glucan samples whose β-D-glucan content were known.Compared the results from three methods，acidic and enzymatic hydrolysis coupled HPLC method were the most suitable for quantitative analysis of β-D-glucans in Lentinan.RSD of the method were 2.02%～2.94%.

Key wordsLentinan，β-D-glucan，acidic and enzymatic hydrolysis，HPLC

Detemination of β-D-glucan in Lentinan by Acidic and Enzymatic Hydrolysis Coupled HPLC

Yu Ya-juan，Dai Jun，Zhu Song，Chen Shang-wei，Jiang Bo
(Sate Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(戴軍教授為通訊作者)。

*國家自然科學基金(31171688)

2012-04-10，改回日期:2012-06-07