重組人生長激素對癲癇持續狀態大鼠神經元凋亡及XIAP、Caspase－3表達的影響

郝慶偉，鄭輯英，李光來，薛國芳，耿 瑜

癲癇持續狀態（SE）是常見的臨床急癥，是細胞層面的自身失控性發作。國際癲癇組織定義為癲癇連續發作之間意識未完全恢復又頻繁再發，或發作持續30min以上不自行停止。癲癇連續發作30min后，海馬神經元開始死亡［1］。細胞凋亡是SE后腦神經元死亡的形式之一，在SE后腦神經元死亡過程中扮演重要角色。近年來，一些研究表明，生長激素（GH）能改善大腦缺血缺氧引起的損傷，抑制細胞凋亡，促進細胞存活等作用［2，3］。本實驗通過應用重組人生長激素（rhGH）觀察大鼠SE后大鼠腦組織凋亡相關基因XIAP、Caspase－3的表達情況，探討rhGH干預對SE導致的神經元損傷的影響及其可能機制，以期為rhGH應用于臨床SE的治療提供動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性 Wistar大鼠54只，鼠齡3個月～4個月，體重180g～240g，山西醫科大實驗動物中心提供。重組人生長激素注射液由長春金賽藥業有限責任公司生產；匹羅卡品購自美國Sigma公司；兔抗鼠XIAP多克隆抗體、兔抗鼠Caspase－3多克隆抗體、TUNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒均系武漢博士德公司提供；氯化鋰購自中國醫藥集團上海試劑公司；DAB試劑由北京中杉金橋生物技術有限公司出品；余均為市售分析純品。

1.2 動物分組及模型的建立 選用健康成年雄性Wistar大鼠54只，隨機分為對照組6只，模型組、rhGH組各24只。模型組、rhGH組再分為4個亞組，每個亞組6只，分別對應癲癇持續狀態后6h、12h、24h和48h四個時間點。rhGH組頸部皮下注射重組人生長激素0.1U／（kg·d），對照組、模型組頸部皮下注射等容積生理鹽水。持續一周，1次／24h。注射5d后，除對照組外，其余各組均腹腔注射氯化鋰127mg／kg，18h后再腹腔注射新鮮配制的毛果蕓香堿（匹羅卡品）30mg／kg，對照組給予等容積生理鹽水腹腔注射。觀察大鼠出現癲癇發作的時間和行為表現，癇性發作持續超過30min為SE。在SE達1h時，腹腔注射地西泮10mg／kg，終止癇性發作。在癲癇持續狀態后6h、12h、24h和48h分別斷頭取腦，對大鼠海馬組織進行研究，進行各指標的檢測。驚厥評分采用Racine評分法，出現3級以上發作提示造模成功，造模過程中大鼠出現死亡或不符合模型要求者，予以剔除并隨機補充，以保證每組動物6只。

1.3 標本處理 各相應時間點大鼠用25%烏拉坦4mL／kg深麻醉后，斷頭取腦，大鼠腦組織置入4%多聚甲醛中固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋后，在視交叉后海馬區連續冠狀切片，片厚5μm，每隔15張連續取4張，相鄰切片分為四套，分別進行各指標的檢測。HE染色，光鏡下觀察形態學變化。

1.4 細胞凋亡檢測 采用TUNEL法檢測，按試劑盒提供的方法進行操作，細胞核中有棕黃色顆粒者即為陽性細胞，即凋亡細胞。

1.5 XIAP、Caspase－3檢測 采用SABC法（鏈霉親和素－生物素過氧化酶連接法）免疫組化步驟按照試劑盒推薦方法進行（常規SABC法，DAB染色）。胞漿或核膜染色呈棕黃色為蛋白陽性表達。

1.6 結果處理 每張切片取5個視野，在BI－2000圖像分析系統下用400倍顯微鏡下分別測定每個視野XIAP、Caspase－3、TUNEL陽性細胞個數，然后計算平均陽性細胞數。胞漿或核膜內染色呈棕黃色為XIAP蛋白陽性表達；胞漿或胞核內有棕黃色沉淀物為Caspase－3蛋白陽性表達；細胞核中有棕黃色顆粒者即為TUNEL陽性細胞。

2 結 果

2.1 發作行為觀察 正常對照組均未出現癲癇發作。模型組和rhGH組大鼠在給予匹羅卡品后10min～30min均出現豎毛，流涎，節律性點頭，洗臉樣動作等面部痙攣樣動作，接著出現單側或雙側前肢陣攣、站立，進一步發展為全身強直－陣攣發作，雙側后肢強直，身體背屈，跌倒，反復發作，達到癲癇持續狀態。

2.2 XIAP蛋白的表達 XIAP陽性細胞主要分布在海馬CA1區和CA3區，其陽性細胞染色主要為胞漿、突起及核膜中呈棕黃色。對照組XIAP陽性細胞僅有微量的基礎表達。與對照組相比，模型組6h時XIAP表達開始增強（P＜0.05），12h時XIAP的表達達到高峰（P＜0.05），24h時XIAP的表達開始減弱（P＜0.05），48h時XIAP的表達明顯減弱（P＜0.05）。rhGH組與模型組相比，SE后各個時間點（除6h外）XIAP蛋白的表達均顯著高于模型組（P＜0.05），表現為胞漿及核膜染色，呈棕黃色，胞漿內有棕黃色顆粒聚集。詳見表1。

表1 各組大鼠海馬XIAP陽性細胞數比較（±s）

表1 各組大鼠海馬XIAP陽性細胞數比較（±s）

組別6h 12h 24h 48h對照組12.71±1.66模型組 27.35±1.991） 42.05±2.191） 36.17±2.111） 25.43±1.381）rhGH組 32.24±1.251） 55.90±2.371）2） 44.32±1.221）2） 36.92±2.011）2）與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

2.3 Caspase－3蛋白的表達 Caspase－3陽性細胞主要分布在海馬CA1區和CA3區，其陽性細胞染色主要表現為胞漿或胞核內有棕黃色沉淀物。正常對照組可見大鼠海馬內少量的弱染色的、散在的Caspase－3陽性細胞。與對照組相比，模型組6 h時可見海馬區內陽性細胞數開始增多；12h時可見較多細胞的胞漿和核內出現棕黃色沉淀物；隨時間點延長而表達增加，24 h時陽性細胞及染色深度達高峰；48h時減少。rhGH組與模型組相比，6h時陽性細胞數差異無統計學意義；12h時可見較多陽性細胞，染色較深；Caspase－3陽性細胞仍在24h達高峰，但相應時間點Caspase－3陽性細胞的表達較模型組輕微，各時間點Caspase－3表達差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠海馬Caspase－3陽性細胞數比較（±s）

表2 各組大鼠海馬Caspase－3陽性細胞數比較（±s）

組別6h 48h對照組2.34±1.13模型組 13.15±1.831） 26.44±1.091）rhGH組 11.36±2.181） 14.05±1.271）2） 23.05±2.541）2） 17.37±2.171）2）與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

2.4 細胞凋亡檢測 TUNEL陽性細胞要分布在海馬CA1區和CA3區，其陽性細胞核染色呈棕黃色。對照組僅有少量的、散在的TUNEL陽性細胞表達，著色較淺。模型組6h時TUNEL陽性細胞表達開始增多，并隨時間點的延長陽性細胞表達增加，24h達高峰，48h減少。與模型組相比，rhGH組TUNEL陽性細胞數仍在24h達高峰，但相應時間點TUNEL陽性細胞的表達均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠海馬TUNEL陽性細胞數比較（±s）

表3 各組大鼠海馬TUNEL陽性細胞數比較（±s）

組別6h 12h 24h 48h對照組3.15±0.67模型組 16.43±1.321） 31.33±2.061） 42.96±1.221） 28.95±2.031）rhGH組 13.86±1.311） 19.15±1.221）2） 31.07±1.241）2） 19.86±1.131）2）與對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05

3 討 論

在大腦癲癇持續狀態損傷過程中，有大量神經元凋亡。細胞凋亡（apoptosis）又稱為程序性細胞死亡，是正常細胞在受到生理性和病理性刺激后，出現的一種自發性死亡過程。細胞凋亡現已成為國內外研究的熱點，在已取得許多非常有價值的成果中，Caspase的蛋白酶在細胞凋亡過程中起了重要的作用，通過特異性地裂解底物而發揮其執行細胞凋亡的作用。目前，人體內發現的IAPs有8個，其中XIAP是唯一可與凋亡啟動因子Caspase－9及效應因子Caspase－3、Caspase－7相結合的凋亡抑制蛋白。

GH是由垂體前葉嗜酸細胞分泌的一種非糖基化蛋白。其主要功能包括促進機體生長，減少蛋白質消耗，同時，GH與神經內分泌及免疫系統有著密切的聯系。GH可以通過抑制酪氨酸磷酸化與干擾素所啟動的信號轉導途徑而下調誘生型一氧化氮合酶的產生，進而減少細胞毒作用，甚至還可以抑制脂多糖誘導單核細胞所產生的腫瘤壞死因子，從而減輕炎癥反應，而這對減輕大腦癲癇持續狀態損傷后減少神經元的凋亡有一定的益處。但其具體機制尚不清楚，有待進一步研究，但這有可能為臨床治療癲癇持續狀態提供一個新的思路和方法。

［1］Edward MM.Status epilepticus：Current treatment strategies［J］.The Neurohospitalist，2011（1）：23－31.

［2］Azcoitia I，Perez－Martin M，Salazar V，etal.Growth hormone prevents neuronal loss in the aged rat hippocampus［J］.Neurobiol Aging，2005，26（5）：697－703.

［3］Shin DH，Lee E，Kim JW，etal.Protective effect of growth hormone on neuronal apoptosis after hypoxia－ischemia in the neonatal rat brain［J］.Neuroscience Letters，2004，354（1）：64－68.