短暫腦缺血對大鼠海馬腦區錐體神經元外向整流氯通道功能的影響

李建國，劉乃紅，陳建鳴

海馬CA1區的錐體神經元對于缺血損傷特別敏感，并且在短暫前腦缺血后呈現遲發性神經元凋亡，而CA3和齒狀回神經細胞不受此影響。目前對這種選擇性細胞死亡的機制仍不清楚［1］。研究表明，細胞凋亡參與了腦缺血后神經元的死亡過程［2］，而且鉀通道和氯通道等離子通道參與細胞的凋亡過程［3，4］。

目前，除了三類已知基因表達的氯離子通道，如配體門控氯通道（甘氨酸受體和GABA受體）、ClC氯通道（ClC1～ClC7，ClC－K1和ClC－K2）和囊性纖維變性調節因子氯通道（CFTR），細胞膜上還分布著一種功能表達的氯通道，即外向整流氯離子通道（outwardly rectifying chloride channels）。這是一種中等電導大小，具有外向整流特性的氯通道。雖然其分子結構仍然不清楚，但是大量的研究發現，外向整流氯離子通道參與了細胞的凋亡性死亡過程［4］，細胞死亡的程度能夠被氯通道阻斷劑所減緩［5］。因此，認為外向整流氯離子通道可能參與了海馬CA1區錐體神經元在缺血后出現的遲發性死亡過程。為探討這種可能性，本實驗運用全細胞膜片鉗技術觀察了短暫前腦缺血后，大鼠海馬CA1和CA3區錐體神經元外向整流氯離子通道活性的變化情況。

1 材料與方法

1.1 腦片的制備與神經元的急性分離 按以往報道的方法急性分離神經元［6］。實驗采用成年雄性 Wistar大鼠（180g～250 g）。麻醉后（水合氯醛40mg／100g）快速斷頭并取出大腦，在振動切片機上切成厚度400μm的腦片。把切好的腦片放置于通以95%O2和5%CO2混合氣的EBSS液中孵育1h～4h，然后分離出海馬腦區并放入用100%O2飽和的HBSS液中用鏈白蛋白酶（protease XIV，1.2mg／mL～1.5mg／mL）消化35 min～40min，放到低鈣羥乙基磺酸鈉緩沖液中吹打，制備成細胞懸液備用，實驗選用形態為錐形或梭形、有基樹突和頂樹突的錐體神經元進行全細胞記錄。

1.2 全細胞電流記錄與數據分析 實驗采用全細胞電壓鉗制技術，電極電阻為3.5MΩ～5MΩ。全細胞電流通過膜片鉗放大器 （Axopatch 200B）由 A／D轉換系統（Digidata 1320）以5 kHz頻率采集，1kHz低通濾波。實驗是在鉗制電壓－40mV的基礎上采用斜坡電壓脈沖程序（從－80mV去極化到＋80 mV，100mV／s），采集頻率為0.1Hz，室溫下記錄。數據采集、分析使用pClamp 10.0軟件。羥乙基磺酸鈉緩沖液成分為：羥乙基磺酸鈉140mmol／L，KCl 2mmol／L，MgCl24mmol／L，CaCl20.1mmol／L，葡萄糖23mmol／L，HEPES 15mmol／L，用1nmol／L NaOH將pH值調定為7.35；浴槽液成分為：NMDG－Cl 140mmol／L，MgCl22mmol／L，Hepes 10mmol／L，葡萄糖10mmol／L，4－AP 2mmol／L，EGTA－Na21mmol／L，用1nmol／LNMDG－OH將pH值調定為7.3；電極內液成分為：NMDG－Cl 25mmol／L，NMDG 115mmol／L，天冬氨酸100，MgCl22mmol／L，EGTA 10mmol／L，Hepes 10mmol／L，EGTA－ Na2ATP 5 mmol／L，用1nmol／L NMDG－OH將pH值調定為7.3。

1.3 腦缺血模型的制備 成年大鼠，分為CA1錐體神經元對照組及缺血再灌注后6h和24h實驗組。采用血管夾閉方法進行短暫前腦缺血（15min）［7］。大鼠以水合氯醛麻醉 （ip，4 0 mg／100g），頸部切口，分離雙側頸總動脈。將大鼠固定于定位儀后，高溫電凝雙側椎動脈，禁食過夜。以這種方法制備的大鼠沒有明顯的腦損害，行為正常。第2天，用動脈夾夾閉清醒的大鼠雙側頸總動脈15min，以造成短暫前腦缺血模型。大鼠在60 s內昏迷，翻正反射消失，痛反射消失，雙側瞳孔放大。腦缺血15min后解除動脈夾，恢復腦血流。具有這些癥狀的大鼠分別存活6h或24h后進行以下的細胞分離。部分腦片經甲醛溶液固定，克紫染色后光鏡觀察。缺血再灌注后出現驚厥等異常表現的大鼠予以排除，實驗中保持37℃的大鼠體溫。

2 結 果

2.1 急性分離大鼠海馬神經元上外向整流氯離子通道的特性實驗采用全細胞膜片鉗技術，鉗制電壓為－40mV。給予斜坡電壓程序（－80mV～80mV）后，可以在細胞上記錄到一個雙向電流。此電流具有外向整流特性，在－80mV時的全細胞電流為（9.11±1.2）pA／pF，在80mV時的全細胞電流為（64.2±6.9）pA／pF。翻轉電位為－36.25mV，接近于本試驗中Cl－的平衡膜電位（－40mV）。氯離子通道阻斷劑DIDS能夠阻斷此通道電流活動。在浴槽液中加入1mmol／L DIDS能夠可逆性阻斷外向整流氯離子通道。在＋80mV膜電位下，通道電流從（64.2±6.9）pA／pF下降到（11.43±13.76）pA／pF（P＜0.01）。詳見圖1。

圖1 大鼠海馬錐體神經元上記錄到的外向整流氯通道全細胞電流圖

2.2 短暫腦缺血后大鼠海馬CA1區錐體神經元外向整流氯通道的功能改變 短暫前腦缺血能夠使海馬CA1區錐體神經元廣泛死亡，腦缺血7d后，CA1區錐體神經元基本全部死亡，而CA3區和齒狀回細胞基本正常。

短暫腦缺血后大鼠海馬CA1區錐體神經元外向整流氯通道電流持續性增強。缺血后6h和24h的全細胞電流從正常的（9.11±1.2）pA／pF（－80mV）和（64.2±6.9）pA／pF（80mV）分別增強為：（15.80±1.70）pA／pF、（17.70±1.93）pA／pF（－80mV）和（120.16±12.30）pA／pF、（129.82±11.83）pA／pF（＋80mV）（P＜0.05），與對照組相比明顯增強。

圖2 短暫腦缺血后大鼠海馬CA1區錐體神經元外向整流氯通道電流圖

2.3 腦缺血前后海馬CA3區錐體神經元外向整流氯通道特性的比較 證明外向整流氯通道活動增強是否為腦缺血后易損海馬神經元的獨特現象，或者僅僅為缺血后神經元的共同反應，這對于闡明外向整流氯通道在缺血性腦損傷中的作用十分重要。因此，我們進一步比較了腦缺血前后的CA3區錐體神經元外向整流氯通道的功能變化。采用同樣全細胞電壓鉗記錄技術，在CA3區錐體神經元記錄到外向整流氯通道電流。

腦缺血前后的全細胞電流圖，其電流值無明顯差異。缺血前和缺血后24h的全細胞電流值分別為（11.4±1.47）pA／pF、（7.97±0.90）pA／pF（－80mV）和（60.14±7.13）pA／pF、（65.66±7.68）pA／pF（＋80mV）（P＞0.05），與對照組相比無明顯變化。

圖3 短暫腦缺血后大鼠海馬CA3區錐體神經元外向整流氯通道電流圖

3 討 論

本研究發現，腦缺血后大鼠海馬CA1區錐體神經元外向整流氯通道的功能活動持續性增強，然而CA3區細胞氯通道電流無明顯改變，這同以前報道的腦缺血再灌注后海馬錐體神經元的細胞膜特性變化相符［8］。以往研究觀察到腦缺血后大鼠海馬錐體神經元同樣出現選擇性興奮性改變，CA1神經元動作電位閾值增加而CA3細胞無變化。因為氯通道開放能夠導致神經元超級化，所以腦缺血后氯通道活動增強導致的細胞超極化可能是CA1區神經元細胞膜興奮性和自發放電頻率降低的機制之一。

蛋白激酶能夠調節外向整流氯通道的活動。酪氨酸激酶p125能夠激活小腸上皮細胞膜上的外向整流氯離子通道，酪氨酸激酶p56也可以激活淋巴細胞膜上的外向整流氯通道，在胞漿側加入酪氨酸激酶抑制劑可以抑制多種細胞上的外向整流氯通道電流［9，10］。酪氨酸激酶可被細胞腫脹和Fas受體信號激活。短暫腦缺血后，CA1錐體神經元中Fas受體蛋白及其配體大量表達。因此，推測腦缺血后外向整流氯通道活動增強可能是由于Fas信號通路激活了酪氨酸激酶所致［11］。這與酪氨酸激酶抑制劑能夠保護腦缺血后CA1區錐體神經元死亡相符合［12］。

不同部位的神經元對缺血損傷的敏感度不同，15min前腦缺血能夠引起CA1區錐體神經元廣泛死亡，然而基本不影響CA3和齒狀回細胞。本實驗發現CA1和CA3區神經元外向整流氯通道對腦缺血傷害性刺激的反應不同，CA1細胞上氯通道電流增強，而在CA3的細胞無顯著變化。因此，認為腦缺血后CA1細胞外向整流氯通道活動持續性增強不但使神經元興奮性進行性降低，而且參與了缺血性神經元損傷，大量研究［13，14］發現氯通道參與多種細胞的凋亡過程也支持我們提出的這一假說。

外向整流氯通道能夠通過轉運HCO3－直接降低細胞內pH值，也能夠通過易化Cl－／HCO3－交換體分泌碳酸氫鹽來間接降低細胞內pH值。細胞內酸化后激活酸性核酸內切酶，進而參與細胞凋亡的過程［15，16］。因此，腦缺血后海馬CA1錐體神經元外向整流氯通道活動持續性增強可能通過降低細胞內pH值促進神經元凋亡。

外向整流氯通道引起的細胞容積改變是細胞凋亡的另一重要機制。研究發現，鉀離子和氯離子經氯通道和鉀通道外流是細胞出現凋亡性容積減少的一個重要因素。而凋亡性容積減少是驅動細胞死亡重要因素，給予通道阻斷劑能夠抑制凋亡性容積減少和細胞凋亡［5］。腦缺血后外向整流氯通道被過渡激活后，通過減少細胞容積誘導海馬CA1錐體神經元凋亡過程的發生。另外，Cl－外流本身亦可通過DNA內切酶活化誘導細胞凋亡。

本實驗發現，腦缺血后CA1神經元外向整流氯通道活動持續性增強，而CA3神經細胞的氯通道無顯著變化，這可能是CA1區椎體神經元對腦缺血易損的一個重要機制。

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