少突膠質前體細胞的培養、鑒定及巨噬細胞移動抑制因子對其促增殖作用研究

段朝霞 張潔元 陳魁君 王建民 李兵倉

1.創傷、燒傷、復合傷國家重點實驗室，重慶 400042；2.第三軍醫大學野戰外科研究所六室，重慶 400042

少突膠質細胞是中樞神經系統的髓鞘形成細胞，它的主要功能是產生髓鞘包繞神經軸突，維持神經沖動沿軸突跳躍性傳導；另外它還分泌多種神經營養因子，支持神經元的生長與存活[1]。少突膠質前體細胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）是處于分化早期階段的未成熟細胞，具有良好的增殖能力，能在體內增殖、遷移，最后分化為成熟少突膠質細胞并為髓鞘形成發揮重要作用。高純度OPCs的制備、培養是一切研究工作的基礎，目前，國內外對大鼠OPCs的培養報道很多，有關小鼠OPCs的培養方法及研究報道還比較少，本文參照國內外文獻報道的新生大鼠OPCs的培養方法[2-3]，探索小鼠OPCs的培養及鑒定，并研究重組巨噬細胞移動抑制因子（rMIF）對其增殖活性的影響，為進一步深入研究其發育、分化以及移植治療脊髓損傷等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

高糖DMEM培養基、胎牛血清為Gibco產品，100 ×N2 添加物為Invitrogen公司產品，PDGF-AA及bFGF為Peprotech公司產品，山羊抗大鼠NG2 抗體、兔抗大鼠GFAP及MBP抗體均為BD公司產品，胰蛋白酶為Invitrogen產品，多聚賴氨酸及多聚鳥氨酸為Sigma公司產品，rMIF及拮抗劑ISO-1 為Sigma公司產品，MTT試劑盒為Sigma公司產品。倒置相差顯微 鏡 （Olympus）、 熒 光 顯 微 鏡 （Leica）、 酶 標 儀 （Thermo labsysytems）。實驗動物為清潔級6～8周齡C57B6 小鼠，雌雄不限，體質量18～25g。由第三軍醫大學第三附屬醫院（所）實驗動物中心提供。

1.2 混合膠質細胞的制備

實驗之前，先將D-Hanks液預冷，取5～8 mL于10 cm無菌培養皿里，并將培養皿放于冰上。取新生C57B6 小鼠（生后48 h內），斷頸處死后將頭埋于冰中1～5min，然后浸入預冷的75%乙醇中消毒。將斷頭放入有預冷D-Hanks液的培養皿中清洗酒精，再將斷頭放入有預冷D-Hanks液的培養皿中，用鑷子壓住鼻部，沿圖1 所示的虛線位置依次剪開新生小鼠腦皮膚、顱骨，取出腦組織，在解剖顯微鏡下用眼科鑷依次剝除腦膜及血管，取大腦（剔除海馬部分，如圖1 所示）置于另一個有預冷D-Hanks液的培養皿中（1次可做5～10只新生小鼠），用眼科剪將組織剪碎，加入0.05%胰酶，用移液槍輕輕吹打幾次（所有過程在冰上操作），充分混勻后，在37℃培養箱內孵育15min，期間混勻幾次，然后加入含血清培養基終止消化。再用70 m細胞篩網過濾細胞懸液，將收集的細胞懸液800 r/min離心5min，棄上清液，再用D-Hanks液清洗一次細胞，加入完全培養基重懸細胞，并進行細胞計數，然后將混合細胞進行培養。

1.3 混合膠質細胞培養

將上一步制備好的細胞懸液按106/mL密度種植于75cm2的玻璃培養瓶中，放入5%CO2培養箱中培養1 h，輕輕吸出細胞懸液（以去除已貼壁的成纖維細胞）接種于預先用多聚賴氨酸處理過的75cm2的一次性細胞培養瓶中，然后將培養瓶放入37℃、5%CO2培育箱培養。第3 天半量換液，以后每3 天完全換液培養，直到9～10 d。顯微鏡下觀察培養細胞，可見瓶底已被星形膠質細胞鋪滿，上層可見散在較多的小圓形折光性好的少突膠質前體細胞。

1.4 少突膠質細胞的振蕩分離和差速貼壁純化

第10 天時，將培養瓶蓋擰緊，用封口膜封口，放于37℃恒溫振動搖床150 r/min，震搖1 h，吸出所有培養上清，再加入新鮮培養基以去除小膠質細胞等雜細胞，然后以300 r/min速度振蕩18～20 h。吸出細胞懸液加入未經多聚鳥氨酸處理的玻璃培養瓶中，60 min后吸出細胞懸液 （此步驟可除去體積較大的星形膠質細胞及成纖維細胞）放入離心管內，800 r/min離心5min，然后無血清培養液（DMEM-F12，含0.5%胎牛血清、5mL/L的 N2、10 g/L的 PDGF-AA、10 g/L的 bFGF）重懸細胞，接種于預先用多聚鳥氨酸處理過的培養瓶或培養板中，每2 d半量換液。

1.5 少突膠質細胞前體系的鑒定

每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長，待細胞長到80%融合時采用抗NG2、PDNFR、GFAP、MBP抗體進行少突膠質細胞前體系的免疫組化鑒定，同時用Hoechst33342 標記細胞核。將細胞標本用新鮮配制的4%多聚甲醛固定10 min；PBS漂洗3次，每次5min；封閉山羊血清或1%BSA室溫下封閉30 min；加入大鼠抗小鼠 NG2、PDGFR、GFAP、MBP 單克隆抗體（1∶100），4℃孵育過夜或 37℃孵育 2 h，PBS 漂洗 3 次，每次5min；加入不同熒光標記的山兔抗大鼠 IgG（1∶1 000）二抗混合工作液，37℃孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5min；再用5μg/mL的Hoechst33342 工作液室溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5min；最后用防止熒光淬滅的封片劑封片，熒光顯微鏡下隨機選擇九個視野，相應激發光下分別觀察NG2、PDNFR、GFAP、MBP 抗體及 Hoechst33342 染色結果。

1.6 細胞增殖的測定

用甲基噻唑基四唑（MTT）試劑盒檢測，嚴格按試劑盒說明書操作。將細胞按104/孔種植于96 孔板，待細胞70%～80%融合時加入不同濃度的MIF，繼續培養48 h后，每孔加10 μL MTT試劑，輕輕混合均勻后，將培養板放于37℃孵育3 h，孵育結束后，96 孔板底部可見黑色顆粒狀物質；輕輕吸掉上層液體，注意不要將黑色顆粒吸出；每孔加入100 μL顆粒溶解液，混勻后成用酶標儀在570 nm處測吸光度值。MIF用5、10、20、40、80 μg/L 5個濃度。

1.7 統計學方法

應用SPSS 11.0 軟件包進行統計學處理，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 混合膠質細胞培養

細胞培養 4～5d后開始出現分層現象，下層為星形膠質細胞，細胞胞體大，培養 7～8 d，星形膠質細胞逐漸融匯連成一片，折光性弱；星形膠質細胞上面貼附著一些對稱雙極或三極突起的細胞，為OPCs或小膠質細胞，它們胞體小，折光性好。

2.2 OPCs的純化與觀察

150 r/min振蕩1 h后，顯微鏡下觀察發現，星形膠質細胞表層松散附著的小膠質細胞大量脫落，可見大量呈圓形或梭形，簇狀聚集的OPCs，經二次振蕩純化后的OPCs胞體呈小圓形，接種到鳥氨酸處理后培養板上很快開始貼壁。2～3 d后細胞呈卵圓形、梭形或三角形，大多數具有典型的雙極突起，部分為三極、多級突起（圖2）。

2.3 OPCs的鑒定

純化的OPCs培養2～3 后可做熒光免疫組化鑒定。結果顯示，OPCs特異性抗原NG2 及PDGFR雙抗陽性細胞占細胞總數90%以上。神經元特異性抗原MAP陰性，星形膠質細胞特異性抗原GFAP陽性細胞約占5%（圖3）。

2.4 MIF對血管內皮細胞增殖的影響

MTT檢測結果用吸光度OD值表示，統計結果顯示，低劑量rMIF能顯著促進肺少突膠質前體細胞的增殖，并具有劑量相應關系（P<0.01），而高劑量rMIF則抑制少突膠質前體細胞的增殖（P<0.01）。見表1。

表1 不同濃度重組巨噬細胞移動抑制因子對OPC增殖情況影響

3 討論

OPCs是CNS中的一類干細胞樣細胞，它能不斷增殖，并最終分化為少突膠質細胞、星形膠質細胞和神經元。要弄清楚OPCs的發育、分化以及在CNS中的更多作用及機制，首先需要建立一個簡便有效的離體培養方法。近年來，對于大鼠的OPCs的培養方法很多，如密度梯度法、免疫吸附法、神經干細胞定向分化培養法、振蕩分離純化法等[4-5]，但參照這些方法培養小鼠OPCs效果卻不理想，并且密度梯度法操作復雜，容易引起細胞死亡，所獲得的細胞純度也低；而免疫吸附法及神經干細胞定向分化培養法的實驗儀器要求高，操作過程繁瑣，實驗成本高。本實驗參照國內外新生大鼠的培養方法及Dincman等[6]的新生小鼠OPCs的培養方法，結合實驗室的具體條件，采用振蕩分離及差速貼壁的純化方法，按照Dincman等[6]的方法采用添加有 N2、PDGF-AA、bFGF的無血清培養基傳代培養，結果獲得了較高純度及高密度的少突膠質前體細胞系。國外文獻[7-8]報道小鼠OPCs的制備，一般采用免疫磁珠法純化，這方法純化OPCs成本比較大，另外由于OPCs在不同發育階段表達的特異性標志蛋白不一樣，使用免疫磁珠法純化的OPCs數量太少。

本實驗采用新生小鼠獲得了較高純度OPCs，分析原因有主要以下幾方面：①所有步驟都在冰上操作，保持細胞活性。②在剝除腦膜時，應該在解剖顯微鏡下操作，保證腦膜及血管等組織完全剝離，這樣會減少雜細胞污染。③腦膜剝離干凈的腦組織盡量用眼科剪剪碎，否則組織塊太大，胰酶不易消化完全，導致細胞產量低。④收集細胞時離心速率不要太高，800 r/min即可，重懸細胞時不要用移液槍反復吹打，否則影響細胞活力。⑤采用無血清培養基非常重要，既可增加OPCs的產量，也可使細胞保持未分化狀態[9-10]。如果采用含血清培養基則容易分化成星型膠質細胞，表達GFAP抗原；若不添加任何成分，則細胞基本不生長，不容易存活，并容易分化成少突膠質細胞。本實驗所培養細胞從形態上觀察是典型的少突膠質前體細胞系；特異性抗體的免疫熒光圖片顯示其在整個少突膠質細胞膜及突起上均有表達，證實所培養的細胞為少突膠質祖細胞及未成熟少突膠質細胞；細胞純化率達90%以上。

MIF是T細胞來源的一種可溶性淋巴因子，最初發現它可抑制巨噬細胞的遷移并在炎癥局部活化巨噬細胞，并且它可作為垂體激素和免疫調節劑及促炎細胞因子發揮作用。在正常中樞神經系統中，能夠表達于星形膠質細胞、室管膜細胞及脈絡叢上皮細胞。在大鼠脊髓損傷后，腦脊液中的MIF表達迅速增加；在其他腦部疾病如中風、腦缺血缺氧等損傷過程中，MIF的表達有明顯的變化[11-13]，說明MIF在腦損傷及修復過程中起著非常重要的作用。本研究初步證實，MIF可促進OPCs增殖，說明MIF在中樞神經系統疾病的發生發展中起重要作用，但其具體機制有待于進一步研究。

[1] Bradl M，Lassmann H.Oligodendrocytes biology and pathology[J].Acta Neuropathol，2010，119：37-53.

[2] Niu JQ，Wang LY，Liu SB，et al.An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells[J].Journal of Neuroscience Methods，2012，209：241-249.

[3] 王興啟，劉軒，楊麗華，等.高純度少突膠質前體細胞改良培養方法的建立[J].上海交通大學學報：醫學版，2010， 30（11）：1444-1447.

[4] 吳波，任先軍.新生大鼠大腦皮層少突膠質前體細胞的培養分離及鑒定[J].中國矯形外科雜志，2008，16（22）：1726-1724.

[5] Langkamp M，Hornig SC，Hornig JB，etal.Detection ofmyelin autoantibodies：evaluation of an assay system for diagnosis of multiple sclerosis in differentiation from other central nervous system diseases[J].Clin Chem Lab Med， 2009，47（11）：1395-1400.

[6] Dincman TA，Beare JE，Ohri SS，et al.Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells [J].Journal of Neuroscience Methods，2009，（2012）：219-226.

[7] Dugas JC，Cuellar TL，Scholze A，et al.Dicer1 and miR-219 are required for normal oligodendrocyte differentiation and myelination[J].Neuron，2010，65：597-611.

[8] Zhao X，He X，Han X，et al.MicroRNA-mediated control of oligodendrocyte differentiation[J].Neuron，2010，65：612-626.

[9] Zhang Y，Zhang J，Navrazhina K，et al.TGFbeta1 induces Jagged1 expression in astrocytes via ALK5and Smad3 and regulates the balance between oligodendrocyte progenitor proliferation and differentiation[J].Glia，2010，58：964-974.

[10] Yang Z，Watanabe M，Nishiyama A.Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival[J].J Neurosci Methods，2005，149：50-56.

[11] 殷章圣，沈麗娟，胡文娟，等.巨噬細胞移動抑制因子研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志，2012，28（5）：549-550.

[12] Wang L，Zis O，Ma G，et al.Upregulation of macrophage migration inhibitory factor gene expression in stroke [J].Stroke，2009，40（3）：973-976.

[13] 王麗麗，郭文俊，熊英，等.巨噬細胞移動抑制因子在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷組織中的表達及作用[J].四川大學學報：醫學版，2011，42（2）：199-203.