煙葉醇化過程中煙堿降解菌的分離鑒定與特性分析

李天麗 ，周亞維 ，湯朝起 ，瞿永生 ，李朋富*

1.南京大學生命科學院，南京市漢口路22號 210093

2.上海煙草集團有限責任公司，上海市楊浦區長陽路717號 200082

烤煙是我國種植面積最大，也是最主要的煙草類型［1］。烤煙收獲、調制后要經過發酵或醇化才能應用于卷煙生產。未經過醇化處理的煙葉，由于其在燃燒過程中會產生令人不愉快的氣味而不宜使用。有研究表明，煙葉醇化過程中，煙堿、蛋白質、氨基酸、高級脂肪酸等物質會發生分解和轉化，形成具有香氣的小分子化合物，進而明顯改善煙葉的香氣和吸味品質［2］。煙葉表面的許多微生物，在發酵過程中發揮了重要作用［1］。Reid等［3］發現，在發酵煙葉上存在的大量細菌，主要是芽孢桿菌屬（Bacillus）。16S rDNA序列分析顯示，在醇化煙葉表面鑒定出多達42種細菌，其中以芽孢桿菌屬、假單胞菌屬（Pseudomonas）和噬菌弧菌屬（Bacteriovorax）為主［1，4］。然而，對于煙葉醇化過程中微生物活性的研究報道較少。

煙堿是存在于煙草中的主要生物堿，對人體健康具有危害性［5］。因此，降低煙草制品和煙草廢棄物中的煙堿已成為一個必需解決的問題。利用微生物來降解煙堿受到人們越來越多的關注。從煙葉表面和種植煙草的土壤中，人們已分離到了很多可以降解和利用煙堿的細菌，包括假單胞菌（Pseudomonas sp.）［6-7］、節桿菌（Arthrobacter sp.）［8-9］、 腸 桿 菌（Enterobacter cloacae）［10］、無 色 桿 菌（Achromobacter nicotinophagum）［11］、 纖 維 菌（Cellulomonas sp.）［12］、爭論產堿菌（Alcaligenes paradoxus）［13］、中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）［14］、芽孢桿菌（Bacillus simplex）［15］、紅 球菌（Rhodococcus sp.）［16］、劍 菌（Ensifer sp.strain N7）［17］、土壤桿菌（Agrobacterium sp.）［18］、申氏桿菌（Shinella sp.）［19］、不動桿菌（Acinetobacter sp.）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）［20］。然而，關于醇化過程中煙葉表面微生物對于煙堿降解能力的報道卻不多見，因此，從醇化煙葉表面分離和鑒定了具有降解煙堿活性的菌群和單菌，并分析了其降解特性。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器和培養基

2009年河南產X2F等級煙葉（醇化6個月，上海煙草集團有限責任公司提供）。煙堿（純度 >98%，洛陽天科生物工程公司）。

儀器：變性梯度凝膠電泳（DGGE），CBS電泳裝置（美國CBS公司）；紫外可見分光光度計（UV-1800型，上海美譜達儀器有限公司）；MJ MiniTMThermal cycler PCR儀（美國Bio-RAD公司）；HP6890型氣相色譜/HP5975型質譜聯用儀（美國Agilent公司）；高效液相色譜（美國Waters公司）。

富集培養基（RM）：5.57 g Na2HPO4，2.44 g KH2PO4，1g K2SO4，0.2 g MgCl2·6H2O，10 mL微量元素溶液（0.04 g MnCl2·4H2O，0.1 g FeCl3·6H2O，0.1 g CaCl2，用蒸餾水配制成100 mL），加蒸餾水到 1000 mL。培養基滅菌 20 min后，將經過孔徑0.22 μm濾膜過濾后的煙堿加入，濃度為 1 g/L。分離培養基：富集培養基+15 g/L瓊脂。

1.2 煙堿降解菌群和單個降解菌的分離

稱取30 g醇化煙葉浸于 300 mL已滅菌的磷酸緩沖液（PBS）中，20℃搖床200 r/min振蕩 2 h后，在超凈工作臺中用滅菌的尼龍篩（250目）和濾膜（Whatman GF/F）過濾，濾液在 6000 r/min轉速下離心15 min，將離心所得細菌接種到 100 mL滅菌的富集培養基中，160 r/min，28℃搖床培養，不斷傳代得到煙堿降解菌群。

菌群傳代30代后，將富集培養菌液稀釋涂布在分離培養基上，30℃下培養 48 h后挑取單菌落，在分離培養基上劃線純化，獲得單菌。

1.3 降解菌群組成分析與單菌鑒定

采用16S rDNA片段的PCR-DGGE技術進行菌群組成分析。參照Tillett和Neilan［21］的方法進行細菌DNA的提取，采用EZ-10 Spin Column（上海生工有限公司）進行DNA純化。16S rDNA片段的PCR擴增采用一對通用引物341F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518r（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）［22］，其中引物341F的5’端連接著GC發夾結構（5’-CGC CCG CCG CGC GCG CGC GGG CGG GGC GGG GGC ACG GGG GG-3’）。PCR采用Touchdown程序：94℃預變性5 min；94℃ 1 min，65～55℃（每循環降低 0.5℃）1 min，72℃ 1 min，循環 21次；94℃ 1 min，55℃1min，72℃ 1 min，循環14次；最后 72℃延伸 20 min。用 2%瓊脂糖電泳檢測PCR產物。DGGE聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，TAE緩沖液（20 mmol/L Tris，10 mmol/L乙酸 ，0.5 mmol/L EDTA，pH8.3），變 性 膠 濃 度 梯 度 為45%～ 65%（100%變性劑為7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺的混合物），點樣量為每孔 500 ng，60℃ 75 V電泳16 h，GelRedTM染料（美國Biotium公司）染色 30 min，用全自動多功能凝膠成像分析系統（720 BR-01503，美國BIO-RAD公司）拍照。切下凝膠上的條帶，放到 1.5 mL離心管中搗碎，加入去離子水 30 μL，4℃過夜使DNA溶出，離心后取上清為模板，用上述同樣的引物（其中，341F不含GC夾）和程序進行PCR擴增，PCR產物由ABI 3730XL DNA測序儀（上海生工有限公司）測序，測序結果提交到EMBL，序列號為HE797795-HE797802。

參照東秀珠等［23］的方法進行單菌菌落形態及生理生化分析。分子鑒定時，單菌DNA提取和純化方法同上，16S rDNA片段的PCR擴增引物為細菌通用引物27F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和 1492r（5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）。將用EZ-10 Spin Column純化后的PCR產物連接到pGEM-T載體中（美國Promega公司）并導入感受態細胞進行克隆，再以陽性克隆子為模板，利用引物為T7（5’-GGC CGC GGG AAT TCG ATT-3’）和 SP6（5’-GCG AAT TCA CTA GTG ATT-3’）進行菌落 PCR，PCR產物由 ABI 3730XL DNA測序儀測序，所得序列提交到EMBL，序列號為HE797794。將測得序列和與其同源性高的序列用多重序列比對軟件CLUSTAL X 1.83進行分析，并采用Mega 4.0構建系統發育樹。

1.4 不同條件下降解菌的生長與煙堿的降解

菌群和單菌的培養液（OD600nm為0.8）接種到 100 mL RM培養基，采用160 r/min搖床培養，定時取樣測定細胞生長和煙堿的降解，每實驗重復3次。

培養溫度：接種菌液為10 mL，煙堿濃度為1 g/L，溫度分別為20，25，28，30和37 ℃。

培養基起始pH：接種菌液為 5 mL，起始pH分別為5，7，9和10，煙堿濃度為 1 g/L，30 ℃下培養。

煙堿起始濃度：接種菌液為 10 mL，煙堿初始濃度分別為 1，2，3和4 g/L，30℃下培養。

1.5 煙葉發酵

2.6 g煙葉浸于150 mL 0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH 7），滅菌后接種 10 mL 菌液（OD600nm為0.8），對照組加 10 mL無菌水，于 30℃下 160 r/min搖床培養，定時取樣測定煙堿的降解量。

1.6 靜息細胞對煙堿的降解和對煙葉中煙堿的降解

取對數生長后期菌液，4℃ 8000 r/min離心 10 min，收集到的細菌用磷酸緩沖液（100 mmol/L，pH7）洗滌3次，再用相同的緩沖液懸浮細胞，使其OD600nm為5.0，5 mL菌液分別接種至 100 mL 0.05 mol/L的pH7磷酸緩沖液（含 1 g/L煙堿）和 150 mL 0.05 mol/L的pH7磷酸緩沖液（含 2.6 g醇化的煙葉）中，30℃ 160 r/min搖床培養，定時取樣測定其煙堿的降解量。

1.7 檢測方法

不加入煙葉的培養基中煙堿含量檢測方法［16］：取培養液，4℃10000 r/min離心 10 min，上清液用一定量的0.05 mol/L HCl稀釋，以 0.05 mol/L HCl作對照，檢測在258 nm處光吸收值，用分光光度法測定煙堿濃度。

加入煙葉的培養基中煙堿含量檢測方法［24］：培養液經離心（12000 r/min，10 min，4℃）后，上清液經0.22 μm的濾膜過濾，用高效液相色譜儀（HPLC）測定煙堿濃度。HPLC色譜柱采用大連依利特Hypersil ODS-2（4.6 mm× 250 mm，5μm），流動相為甲醇與 0.1 mol/L KH2PO4（含三乙胺 0.015 mol/L，磷酸調pH 為4），其甲醇含量梯度為：前 5 min為 5%，5～10 min上升到10%，10～20 min為10%，20～25 min下降到 5%，流速1 mL/min，檢測波長 254 nm，進樣量 10 μL。

1.8 煙堿降解中間產物的分析

取對數生長后期菌液，4℃ 8000 r/min離心 10 min，收集上清液，加入等體積二氯甲烷萃取2 min，室溫下靜置使水相與二氯甲烷分層，移出二氯甲烷，重復萃取兩次，合并萃取液用無水硫酸鈉除水后用旋轉蒸發儀濃縮，而后用氮氣吹干，最后用二氯甲烷定容到1 mL，供GC/MS分析使用。氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm），進樣口溫度為280℃，柱溫箱升溫程序為 60℃（保持 2 min），以10℃/min升溫到300℃（保持 30 min），分流比為10∶1，載氣為氦氣，流速 1.0 mL/min，進樣量為 1 μL。質譜條件：電離化方式為EI，離子源能量為70 eV，離子源溫度為230℃，掃描質量范圍為 20～650 amu，采用美國NIST譜庫檢索。

2 結果與分析

2.1 降解煙堿菌群和單菌的分離

在分離煙堿降解菌群時，共進行了6次重復實驗，均得到了能降解煙堿的菌群，這說明在醇化煙葉的表面存在能夠降解和利用煙堿的菌群。對菌群Q6繼續分析，并采用分離培養基分離降解煙堿的單菌，最后只得到了一株降解菌D1。

2.2 降解菌群的組成分析與單菌鑒定

在通過富集培養分離煙堿降解菌群過程中，利用PCR-DGGE技術分析菌群的組成變化見圖1。從圖1中可看出，在30代后菌群組成較為穩定。對DGGE圖譜上的條帶進行測序分析，主要條帶的BLAST比對結果見表1。

圖1 富集培養過程中煙堿降解菌群組成變化的DGGE分析Fig.1 DGGE profiles of the nicotine-degrading bacterial communities of 5-40 generations during enrichment

菌株D1的菌落形態觀察：菌落呈乳白色，圓形隆起，邊緣光滑整齊，色澤濕潤光亮，生長過程中平板不變色。根據形態特征和生理生化特征（表2），菌株D1初步鑒定為根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）。16S rDNA序列分析表明，菌株D1與根癌土壤桿菌最相似（同源性>98%，如圖2所示）。因此，菌株D1鑒定為根癌土壤桿菌，屬于α-變形菌綱，與菌群Q6的B3條帶所代表的菌為同一種菌。

表1 DGGE圖中各條帶序列的BLAST比對結果Tab.1 BLAST results of the DGGE bands

2.3 培養條件對降解菌生長和降解煙堿能力的影響

培養溫度對菌群和單菌生長及降解煙堿能力的影響如圖3所示，從20℃升高到30℃，菌群和單菌的生長加快和降解煙堿能力增強，而在30℃和37℃時，菌群和單菌的生長和降解煙堿的能力均相近。與D1相比，Q6在20℃表現出更快的降解速率，在 24 h和 36 h Q6對煙堿的降解率分別為13.0%和73.4%，而單菌在相同時間只降解了2.2%和43.6%。

表2 菌株D1的生理生化特性Tab.2 Biochemical and physiological characteristics of strain D1

圖2 基于16S rDNA序列的菌株D1系統發育Fig.2 Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences for strain D1

初始pH對菌群和單菌生長及降解能力的影響如圖4所示，當pH為7時，菌群和單菌的生長最快、對煙堿的降解能力最強，分別達到94.5%和67.2%。當pH升高或者降低均會導致菌群和單菌生長減慢、對煙堿的降解能力減弱。菌群的生長和對煙堿的降解能力比單菌更快、更強，當pH為5，9和10時菌群的優勢更為明顯，在 36 h時菌群對煙堿的降解率分別為94.2%，84.4%和64.3%，而單菌的降解率分別為22.7%，16.6%和5.7%。

圖3 溫度對菌群Q6和單菌D1生長及降解煙堿能力的影響Fig.3 Effects of temperature on cell growth and nicotine degradation of bacterial community Q6 and single bacterial strain D1

圖4 初始pH對菌群Q6和單菌D1生長及降解煙堿的影響Fig.4 Effects of initial pH on cell growth and nicotine degradation of bacterial community Q6 and single bacterial strain D1

煙堿起始濃度對菌群和單菌生長及降解能力的影響如圖5所示，隨著煙堿濃度的升高，菌群和單菌的生長和對煙堿降解均減慢，當煙堿初始濃度為 5 g/L時，菌群和單菌幾乎不能再生長。當煙堿起始濃度為 2，3和 4 g/L時，菌群的生長和降解能力明顯表現出比單菌更快。

2.4 煙葉發酵實驗

如圖6所示，菌群Q6在12 h內將煙堿降解完成，而此時單菌D1降解煙堿速率較慢，在12 h時只有72.5%的煙堿降解。

圖5 初始煙堿濃度對菌群Q6和單菌D1生長及降解煙堿的影響Fig.5 Effects of initial nicotine concentration on cell growth and nicotine degradation of bacterial community Q6 and single bacterial strain D1

圖6 菌群Q6與菌株D1對煙葉中煙堿的降解能力Fig.6 Nicotine degradation during fermentation of tobacco leaves by bacterial community Q6 and strain D1

2.5 靜息細胞對煙堿的降解

如圖7所示，在含煙堿的磷酸緩沖液（圖7a）中，Q6和D1均能在 12 h內將 1 g/L的煙堿完全降解，Q6的降解速率比D1稍快。在加入煙葉的磷酸緩沖液（圖7b）中，靜息細胞在 3 h內能將濃度 112 mg/L的煙堿完全降解，菌群Q6仍表現出略快的降解速率。

圖7 菌群Q6與菌株D1的靜息細胞對煙堿的降解能力Fig.7 Nicotine degraded by resting cells of bacterial community Q6 and strain D1

2.6 煙堿降解中間產物的分析

GC/MS分析顯示，在菌群及單菌的培養液中均檢測到煙堿烯（nicotyrine）、2,3’-聯吡啶（2,3’-dipyridyl）和可替寧（cotinine），見圖8。

3 結論與討論

本試驗分離到的菌群和單菌完全降解煙堿（初濃度 1 g/L）需要 28 h，而已報道的紅球菌Y22降解同濃度煙堿需要 52 h［16］，Ruan 等［9］分離到的節桿菌 HF-2 降解同濃度煙堿需要43 h，Hylin［25］分離的無色桿菌完全降解初濃度0.5 g/L的煙堿需要 56 h，鞘氨醇單胞菌HF-1可在 25 h完全降解初濃度1.3 g/L的煙堿［6］。這表明菌群Q6和單菌D1具有較好的煙堿降解活性。同時也發現菌種在-80℃保藏數月后仍具有同樣的活性，說明菌種具有穩定的煙堿降解活性。

圖8 煙堿代謝產物的質譜圖Fig.8 Mass spectra of the nicotine’s metabolites

從DGGE分析的菌群組成來看，在富集過程中菌群中一直存在一個優勢菌（條帶B6）蒼白桿菌，Yuan等［14］報道，蒼白桿菌具有煙堿降解活性。條帶B2為不動桿菌，Wang等［20］從煙草廢棄物中分離到了具有煙堿降解活性的不動桿菌TW。顯示條帶B2和B6所對應的細菌可能也具有煙堿降解活性。Wang等［18］從種植煙草的土壤中分離到土壤桿菌S33，可在6 h內完全降解初濃度為1 g/L的煙堿，在煙堿初始濃度高于 3 g/L時，其培養液會產生由亮綠色到深棕色的顏色變化。與本試驗分離到的根癌土壤桿菌D1相比，S33具有更好的降解活性。煙堿初始濃度高于3 g/L時，D1菌培養液沒有出現類似于S33的顏色變化，說明D1和S33兩種菌對煙堿的降解途徑不同。

在低溫（20℃）、偏酸或偏堿（pH=5或者pH≥ 9）及高煙堿濃度（>1 g/L）時，菌群Q6均表現出比單菌D1更強的降解活性，表明菌群Q6比單菌D1能適應更復雜的環境條件。靜息細胞對煙堿具有降解能力，可直接利用培養好的細菌處理醇化煙葉或者處理含煙堿的廢棄物。

煙堿的降解途徑多樣，本研究煙堿代謝產物分析中，檢測到煙堿烯，2,3’-聯吡啶和可替寧。在申氏桿菌（Shinella sp.）HZN1的煙堿降解產物中發現了煙堿烯和可替寧［19］，在鞘氨醇單胞菌Nic22和鞘氨醇單胞菌ZUTSKD的煙堿降解產物中發現了2,3’-聯吡啶和可替寧［7，26］。這表明本試驗分離到的菌群和單菌可能與以上報道的細菌具有相似的煙堿降解途徑。

本研究從醇化煙葉表面分離到了具有煙堿降解活性的菌群和單個細菌，菌群在低溫（20℃）、偏酸或偏堿（pH=5或者pH≥ 9）及高煙堿濃度（>1 g/L）時，均表現出比單菌更強的降解活性。發酵試驗以及加入靜息細胞試驗顯示，菌群和單菌均能降解煙葉中的煙堿。醇化煙葉表面存在煙堿降解菌和降解菌群，在煙葉醇化過程中微生物可能會參與煙堿的降解，從而影響煙葉醇化效果，醇化過程中可以考慮利用煙堿降解菌群或單個細菌來更好地降解煙堿。另外，也可以考慮利用煙堿降解菌群和單菌來處理煙草工業生產過程中產生的含有煙堿的廢棄物。因為菌群的降解效果優于單個細菌，并具有更強的環境適應能力，菌群可能具有更好的應用前景。

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