黃連解毒湯對膿毒癥大鼠的心臟保護作用1）

黃 鑫，郭力恒，馬世玉，張敏州，王 磊

膿毒癥是臨床上常見的急危重癥并發癥，其發展所致的重度膿毒癥、膿毒癥休克、器官功能障礙綜合征（MODS）等死亡率很高，是目前ICU中的主要死亡原因。雖然近年來對膿毒癥及MODS的認識和治療研究有了很大進展，但MODS的病死率仍沒有明顯改善，發病機制仍不清楚，很多研究人員致力于尋找降低器官功能衰竭發生率和嚴重程度，阻止膿毒癥向膿毒性休克和MODS發生的治療措施。研究發現，膿毒血癥、伴有臟器功能衰竭的重度膿毒血癥或膿毒性休克病人常常出現不同程度的心功能障礙或心力衰竭，而心功能障礙又是膿毒血癥病情加重及影響預后的重要因素[1，2]。本研究嘗試從心臟角度探討清熱解毒方劑黃連解毒湯對膿毒癥后心肌的保護作用，為尋找中醫藥防治膿毒癥心功能障礙提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 清熱解毒方劑黃連解毒湯組方：黃連10g，黃芩10g，黃柏10g，梔子10g，大黃10g。中藥經水提取，濃縮為含生藥0.75g／mL作為高劑量，用蒸餾水稀釋，調整濃度為含生藥0.25g／mL作為低劑量。按人鼠劑量比1∶6.3灌胃，即100g大鼠灌胃量為1.5mL，密封包裝，放入冰箱備用。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只，體重為（220±10）g，廣東省醫學實驗動物中心提供。實驗動物合格證號：粵監證字0083834；動物實驗環境設施合格證號：粵監證字0056182。

1.3 儀器 BIOPAC sYSTEMS（MP150型）16道生理系統記錄儀（美國），正置熒光顯微鏡（奧林巴斯BX53），Anke TDL－5－A低溫離心機、LIBROR AEU－210型電子分析天平、DT－1TB電子體溫計（上海醫用儀表廠）等。

1.4 盲腸結扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型 參照文獻[3]中設計的大鼠盲腸結扎穿孔（CLP）方法復制膿毒癥模型。大鼠術前禁食12h、自由飲水，稱體重后10%水合氯醛（0.35mL／100g）進行腹腔注射麻醉，在無菌操作條件下取中下腹部正中切口2 cm，將盲腸提出，用4號絲線在盲腸中段結扎，用18G針頭在結扎部位與盲腸末端的中段對穿兩孔，使腸內容物流出，然后將盲腸還納腹腔后逐層關腹。術畢動物皮下注射平衡液50mL／kg行液體復蘇，喂食同術前。

1.5 實驗分組與給藥 50只大鼠隨機分為假手術組、模型組和黃連解毒湯組。假手術組除不結扎和穿刺盲腸，余同模型組；模型組采用盲腸結扎并穿刺法造模，術前1h給予注射生理鹽水（10mL／kg）灌胃；黃連解毒湯組術前1h灌胃黃連解毒湯1.5mL／100g。

1.6 檢測指標 每天觀察記錄大鼠的生存狀態（精神狀態、飲食、體重等），觀察記錄大鼠生存時間。內眥靜脈叢采血法分別在術前、術后收集血液，離心（3 000r／min，4℃，7min）后，免疫化學發光法檢測血清肌酸激酶（CK）及其同工酶（CK－MB）水平，ELISA檢測血液中腫瘤壞死因子（TNF－α）水平。采血后留取左室心肌標本，用10%甲醛固定，進行病理切片并行HE染色后在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理改變。

2 結 果

2.1 大鼠生存周期的觀察 大鼠在CLP造模后出現寒戰、豎毛、嗜睡、活動減少、飲食減少等膿毒癥的表現，證明造模成功。72h內假手術組大鼠無死亡；模型組24h死亡數量顯著增加，72h后僅余2只存活；黃連解毒湯組24h死亡7只，72h后仍有8只存活。與模型組比較，72h內黃連解毒湯組生存周期延長（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組生存周期比較（±s）

表1 各組生存周期比較（±s）

組別 n 死亡（只）24h48h72h存活只平均生存天數d假手術組10 0 0 0 6 3模型組 20 12 5 1 2 1.55±0.171）黃連解毒湯組 20 7 3 2 8 2.15±0.211）2）與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.2 各組大鼠呼吸、心率和體溫的變化 在造模后，分別檢測各組大鼠的呼吸、心率和體溫。結果顯示，模型組和黃連解毒湯組大鼠體溫升高，呼吸頻率、心率增快，與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，黃連解毒湯組大鼠體溫下降，呼吸頻率、心率減慢，差異有統計學意義（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠心率、呼吸、體溫比較（±s）

表2 各組大鼠心率、呼吸、體溫比較（±s）

組別 心率（次／min） 呼吸（次／min） 體溫（℃）假手術組361.6±12.4 87.2±3.2 34.88±0.15模型組 551.0±4.91） 143.8±4.81） 38.48±0.111）黃連解毒湯組 454.0±16.51）2） 113.2±8.11）2） 37.32±0.391）2）與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

2.3 各組大鼠血清CK、CK－MB水平檢測 模型組和黃連解毒湯組大鼠的CK和CK－MB水平均有所上升，與假手術組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，黃連解毒湯組大鼠CK和CK－MB水平有所下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 各組大鼠血清TNF－α水平檢測 模型組和黃連解毒湯組大鼠的TNF－α水平有所增加，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），與模型組相比，黃連解毒湯組大鼠TNF－α水平有所下降（P＜0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠血清心肌酶和TNF－α水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清心肌酶和TNF－α水平比較（±s）

組別 CK（ng／mL） CK－MB（ng／mL） TNF－α（ng／L）假手術組435.2±30.4 481.8±32.5 182.81±13.68模型組 871.4±21.71） 988.0±30.91） 353.41±12.051）黃連解毒湯組 621.3±19.11）2） 753.6±25.51）2） 251.60±11.131）2）與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05

2.5 大鼠心肌組織形態學變化 假手術組心臟標本心肌細胞無變性壞死，心肌橫紋清晰，未見炎癥細胞浸潤；模型組心臟標本可見灶性心肌纖維斷裂，心肌細胞有顆粒樣變性、空泡變性和凝固性壞死，冠狀動脈內明顯充血；黃連解毒湯組雖可見上述病理改變，但程度有所減輕。

3 討 論

膿毒癥被定義為感染誘發的全身炎癥反應[4]，是臨床常見的急危重疾病之一。美國每年有75萬的膿毒癥患者，約有21.5萬人死亡[5]。我國10家外科ICU一年嚴重膿毒癥的發病率為8.68%，住院期間總死亡率為48.7%，平均每個病人住院費用約11 000美元[6]。近年來，盡管早期積極抗感染、液體復蘇和器官支持等治療方法的應用，但膿毒癥總體死亡率并沒有明顯下降。中醫藥治療感染性疾病有豐富的臨床經驗，在這個偉大的寶庫中尋找新的膿毒癥的防治方法被寄予厚望。

從癥狀表現和演變過程來看，膿毒癥與《傷寒論》和《溫病》中所論述的溫熱病有諸多相似之處，故膿毒癥屬于中醫學“熱病”范疇。黃連解毒湯是清熱解毒方中的經典方劑，該方由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，具有瀉火解毒之功效，是歷代清熱解毒的代表方，主治實熱火毒、三焦熱盛之證。翁書和等[7]用以黃連解毒湯加減方治療MODS大鼠模型，結果顯示黃連解毒湯對MODS大鼠的臟器有明顯保護作用，并且可以明顯延長MODS大鼠的存活時間，其機制可能與抑制或清除有害炎癥介質及腸道細菌和毒素有關。

盲腸結扎穿孔（CLP）法制備膿毒癥動物模型與臨床上患者膿毒癥的發病極為相似，是制作膿毒癥、感染性休克及 MODS模型的常用方法之一。本試驗中發現，模型組大鼠在造模后出現寒戰、豎毛、嗜睡、活動減少、飲食減少，并且出現體溫升高、呼吸頻率、心率增快等膿毒癥的表現，其72h后只有2只大鼠存活。將死亡大鼠進行解剖，發現腹腔有較多黃色或血色腹水，并伴有惡臭；腸管壁充血、腫脹，符合腹腔感染所致膿毒癥模型。而假手術組則未見相應表現，72h后未出現死亡。黃連解毒湯組則上述癥狀有所減輕，72h后仍有8只大鼠存活，生存時間明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示黃連解毒湯能夠減輕大鼠膿毒癥表現，并延長大鼠的生存時間，與文獻[7，8]報道一致。

膿毒癥的死亡率與心功能密切相關，膿毒癥患者一旦出現心功能障礙，死亡率將由20%上升到40%～70%，已有研究證實膿毒癥可引起心肌收縮功能抑制[9]。Labugger等[10]研究發現膿毒癥時心臟不僅存在功能性改變，也存在結構性損傷。心肌酶及其同工酶是反應心肌損傷的敏感指標。本實驗中發現模型組血清CK和CK－MB較假手術組顯著升高（P＜0.01），提示膿毒癥早期即發生心肌損傷。病理檢查發現模型組心肌表面有點狀出血，光鏡下可見廣泛心肌出血，毛細血管充血，炎癥細胞浸潤，心肌纖維斷裂，證實膿毒癥確實存在心肌損害。而黃連解毒湯組大鼠心肌組織病理改變有所減輕，且血清中CK和CK－MB水平較模型組有所下降（P＜0.01），提示黃連解毒湯對膿毒癥大鼠心臟具有保護作用。

TNF－α是膿毒癥時最早釋放，起關鍵始動作用的細胞因子，可激活細胞因子級聯反應，誘發IL－1、IL－6、前列環素、一氧化氮（NO）和白三烯等合成，從而導致炎癥反應失控，是炎癥反應中激活細胞因子級聯反應的主要介質。其濃度高低與疾病的嚴重程度和后果一致，TNF－α的濃度越高，膿毒癥越嚴重，死亡率越高。本實驗結果顯示，膿毒癥大鼠血清TNF－α水平明顯增高，而黃連解毒湯可降低膿毒癥大鼠的TNF－α濃度，減輕心肌細胞的炎癥反應，證明黃連解毒湯對膿毒癥的治療機制可能是通過抑制炎癥反應從而改善膿毒癥大鼠的心功能。

黃連解毒湯有延長膿毒癥大鼠的生存時間、減輕炎癥因子對的心臟損傷、保護大鼠心臟功能的作用。本研究為臨床應用中醫藥防治膿毒癥提供了一條新的思路，但黃連解毒湯治療膿毒癥的心功能障礙的具體機制仍有待進一步研究。

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