消癌平注射液高效液相色譜指紋圖譜的建立

付曉秀，周國威，齊永秀

(1.山東省聊城市第二人民醫院，山東 聊城 252600;2.泰山醫學院，山東 泰安 271000)

1 儀器與試藥

Waters 600型高效液相色譜儀(美國Waters公司);Empower色譜工作站(美國Waters公司);KQ－500E型醫用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。綠原酸對照品(批號為110753－200413，中國藥品生物制品檢定所);消癌平注射液(通化神源藥業有限公司);甲醇為色譜純(TEDIA);磷酸(H3PO4)、磷酸二氫鉀為分析純;蒸餾水(試驗室自制雙蒸水)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Diamonsil? C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相:A(甲醇)∶B(磷酸－磷酸二氫鉀)，梯度洗脫(表 1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:327 nm，柱溫:室溫;進樣量:20 μL。在上述色譜條件下，消癌平注射液的9個色譜峰均得到良好分離。高效液相色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇溶解并定容，得綠原酸對照品溶液(200 μg/mL);精密移取消癌平注射液1 mL于10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

精密度試驗:精密吸取同一批供試品溶液20 μL，按擬訂色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。以綠原酸色譜峰(3號峰)為參照，計算10批供試溶液各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果的 RSD均小于3%，精密度良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

表1 梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

重復性試驗:取同一批消癌平注射液，按2.1項下方法制備供試品溶液6份，并各吸取20 μL，按擬訂色譜條件分別測定，記錄色譜圖。以綠原酸色譜峰(3號峰)為參照，計算10批供品試溶液各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果的 RSD與相對峰面積 RSD均小于3%，說明方法重復性良好，符合指紋圖譜的檢測要求。

穩定性試驗:精密吸取同一批消癌平供試品溶液20 μL，按擬訂色譜條件測定，分別記錄 0，1，3，7，12，24 h 時的色譜圖。以綠原酸色譜峰(3號峰)為參照，計算10批消癌平供試品溶液各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果的 RSD均小于3%，消癌平供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.4 高效液相指紋圖譜的構建

共有指紋峰的標定:取10批消癌平注射液，分別按2.1項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行指紋圖譜測定，同時在該色譜條件下對綠原酸對照品溶液進樣分析。結果見圖2，其中3號色譜峰鑒定為綠原酸。

圖2 綠原酸和10批消癌平注射液的指紋圖譜

指紋圖譜相似度評價:將試驗數據導入國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”。參數設置為1)指紋圖譜積分參數，峰寬0.5，最小峰面積0.3，最小峰高1;2)參照譜圖，采用其中一批樣品指紋圖譜為參照譜圖;3)時間窗寬度，0.30;4)數據剪切，0～5 min內為非保留組分色譜峰和溶劑峰，為避免對相似度值的影響，供試品指紋圖譜中0～5 min內的色譜峰予以剪切，得到消癌平特征圖譜的共有模式圖(圖3)。計算10批消癌平注射液特征圖譜的相似度(見表2)。從表中數據可以看出，各批樣品的相似度均大于0.9，相似度良好。

圖3 消癌平注射液指紋圖譜的共有模式圖

表2 10批消癌平注射液特征圖譜的相似度

共有峰相對保留時間、相對峰面積:3號峰為綠原酸峰，峰面積穩定，分離度良好，將其作為參照峰。以綠原酸峰(3號峰)的保留時間和色譜峰面積為1，計算各特征峰的相對保留時間(表3)和相對峰面積(表4)。10批消癌平注射液中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積均小于2%，符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求》中的有關規定。

表3 10批消癌平注射液高效液相指紋圖譜相對保留時間

表4 10批消癌平注射液高效液相指紋圖譜相對峰面積

3 討論

對甲醇－水，乙腈－水，甲醇－磷酸二氫鉀緩沖液(磷酸調pH至3.0)，乙腈－0.1% 磷酸等不同組成、不同比例的流動相體系進行試驗。結果峰形良好，保留時間穩定且分離度較好，故選用該系統為流動相。

本試驗采用高效液相色譜法建立了消癌平注射液的指紋圖譜，克服了只由單一化學成分作為質量控制指標的難題，為消癌平注射液的總體研究提供了更加系統和微觀的信息。通過相似度計算可知，10批樣品的相似度均在0.9以上，結果表明各樣品指紋圖譜雖存在一定差異，但均具有相同的色譜特征峰，且各色譜峰的保留時間匹配較好，說明所建立的指紋圖譜具有較好的穩定性和可控性，為消癌平注射液的抗癌性成分在質量控制方面的研究提供了相關的理論參考依據，不足之處是尚需對高效液相色譜指紋圖譜中特征指紋峰進一步指認。

[1]劉順開.河南省新鄉市前衛制藥廠.消癌平有效成分的提取及劑型制備[P]:中國，92102027:1993－10－06.