高效液相色譜法與化學發光酶免疫分析法測定丙戊酸血藥濃度的比較

范 毅，錢南萍，陳 斌

(江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300)

丙戊酸是一種廣譜抗癲癇藥，可作為癲癇小發作、大發作和肌陣攣的首選藥物之一，有效血藥濃度為50～100 μg/mL，由于治療窗窄、個體差異大、不良反應和血藥濃度相關，中毒癥狀與癲癇發作癥狀難以判斷。為最大限度地發揮療效和避免不良反應，及時監測其血藥濃度[1]，根據患者的實際臨床情況實施個體化用藥尤為重要。筆者采用高效液相色譜法[2－5]與化學發光酶免疫分析法[6－7]分別測定丙戊酸血藥濃度，比較二者的監測結果，分析其相關性[8－11]，為臨床合理用藥提供依據。

1 儀器與試藥

高效液相色譜系統(美國Waters公司)，包括2487型雙通道紫外檢測器、1525型二元泵、Empower色譜工作站;80－2型離心機(上海安亭科學儀器廠);YW－2型吹氣式濃縮干燥器(南京和諧色譜配件研究所);DKZ－2型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司);GM－0.33隔膜真空泵(天津市騰達過濾器件廠);XW－80A漩渦混合器;AXSYM化學發光酶免疫分析儀(美國雅培公司)等。丙戊酸對照品(美國 Sigma公司，批號47H3481);內標環己烷羧酸(CHCA，美國Aldrich Chem公司);衍生化試劑:2－溴－對硝基苯乙酮 (比利時Acros Organics公司);甲醇、三乙胺、乙腈、正己烷均為色譜純，其他試劑為分析純;化學發光酶免疫法丙戊酸檢測試劑由美國雅培公司提供。

2 方法與結果

2.1 樣品采集

46例確診為癲癇的門診和住院患者，男26例、女20例，服用丙戊酸達穩態后(10～14 d)，于末次服藥的次日晨服藥前采靜脈血3 mL，以2 500 r/min的速度離心5 min，取血清置4℃冷藏備用。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Hypersil BDS C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －水 (80∶20);流速:1.0 mL/min;檢測波長:265 nm;柱溫:室溫;進樣量:10 μL。在此條件下，色譜圖見圖1。丙戊酸的保留時間為4.8 min，峰形良好，血漿對丙戊酸的測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

丙戊酸對照品溶液:準確稱取丙戊酸對照品50 mg，置10 mL容量瓶中，加0.2 mol/L氨水稀釋至刻度，搖勻，即得5 000 μg/mL的對照品溶液。內標液:準確稱取環己烷羧酸(CHCA)，以正己烷配制成質量濃度為4.8 μg/mL的內標溶液。衍生化試劑:以乙腈溶解 2－溴－對硝基苯乙酮，配制成5.0 g/L的溶液，避光保存。三乙胺應用液:用乙腈稀釋三乙胺，配制成0.2%的溶液。

2.2.3 血清樣品處理

取血清樣品 250 μL，加 1 mol/L硫酸 250 μL，加 CHCA 提取液 1 mL，混勻振蕩 0.5 min，離心 8 min(3 500 r/min)，取上層提取液 600 μL，吹干后加三乙胺應用液 100 μL、衍生化試劑 50 μL，振蕩混勻，45℃水浴15 min，吹干后用100 μL流動相溶解，取10 μL 進樣。

2.2.4 方法學考察

標準曲線繪制:精密取丙戊酸對照品溶液適量，加健康人的空白血清分別稀釋成 10，20，40，80，120，180 μg/mL 的丙戊酸系列標準溶液，按2.2.3項下方法處理后進樣測定，并以質量濃度(X)對丙戊酸和內標的峰高(Y)比作線性回歸，得回歸方程 Y=0.003 8 X －0.015 1，r=0.998 9(n=6)。結果表明，丙戊酸質量濃度在10～180 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度和回收率試驗:準確配制40，80，180 μg/mL 3種質量濃度的丙戊酸血清樣本各5份，按2.2.3項下方法處理后，并于日內及隔日進行測定，計算日內、日間精密度及方法回收率。結果見表1。

表1 HPLC法精密度及回收率試驗結果(±s，n=5)

表1 HPLC法精密度及回收率試驗結果(±s，n=5)

理論濃度(μg/mL)精密度試驗(%) 回收率試驗40 80 180日內RSD 4.35 1.78 4.17日間RSD 4.71 3.23 4.65測定濃度(μg/mL)41.35±0.61 78.56±2.84 183.71±1.01回收率(%)103.38 98.20 102.06

穩定性試驗:取正常人血清配制濃度為80 μg/mL的丙戊酸血清樣本各3組(2管/組)，第1組室溫放置，第2組于－18℃冷凍放置15 d，第3組于－18℃冷凍存1個月，分別于0，6，12 h時取樣，按2.2.3項下方法操作進行測定比較。結果顯示，血清樣品中丙戊酸的含量在室溫和反復凍融條件下未發生明顯變化。

2.3 化學發光酶免疫分析法(CLEIA)測定

2.3.1 測定方法

采用微粒子固相免疫競爭法，借助化學發光基質產生光子，然后根據化學發光體系中的光子發光強度的大小，測定微量的抗原或抗體。

2.3.2 方法學考察

標準曲線制備:取丙戊酸標準曲線盒中 0，12.5，25，50，100，150 μg/mL的丙戊酸標準品，加入AXSYM分析儀器的樣品杯中，按儀器操作指南操作檢測結果，儀器自動生成1條標準曲線存儲于程序中，得回歸方程為 Y=6.944 9 X－7.502 3，r=0.999 2(n=6)。

精密度和回收率試驗:選擇高、中、低3種質量濃度的丙戊酸標準樣本各5份，按CLEIA方法操作處理，并于日內及隔日進行測定，計算日內、日間精密度及方法回收率。結果見表2。

表2 CLEIA法精密度及回收率試驗結果(±s，n=5)

表2 CLEIA法精密度及回收率試驗結果(±s，n=5)

理論濃度(μg/mL)精密度試驗(%) 回收率試驗20 80 150日內RSD 1.17 2.31 2.53日間RSD 3.06 3.91 4.19測定濃度(μg/mL)19.86 ±0.78 82.33 ±1.25 151.75 ±2.42回收率(%)99.30 102.91 101.17

2.4 兩種方法相關性評價

用HPLC法和CLEIA法平行測定46例患者丙戊酸血藥濃度，以HPLC法測得的濃度(X)對CLEIA法測得的濃度(Y)作線性回歸，得回歸方程為 Y=0.980 2 X+2.477 7(r=0.979 3)，回歸曲線見圖2。結果表明，兩種方法測得的結果顯示出良好的相關性。將丙戊酸樣品的HPLC法測定結果和CLEIA法測定結果進行配對 t檢驗，兩種方法的測定結果在統計學上差異無顯著性(P ＞0.05)。

圖2 兩種方法相關性回歸曲線圖

3 討論

丙戊酸可以單獨使用或與其他抗驚厥類藥品聯用，用于對失神發作的治療，由于能夠達到治療多種類型發作的目的得以廣泛使用。根據我院的試驗條件，可以用HPLC法和CLEIA法測定丙戊酸血藥濃度，HPLC法準確、特異性好、靈敏度高，其缺點是測定周期長，技術要求高，適用于試驗要求較高的藥動學的研究;CLEIA法試劑無毒、無污染、安全穩定、樣品用量少，用時短，適用于臨床急救及大批生物樣品的常規血藥濃度監測，大大提高了醫院的工作效率，其缺點是儀器與試劑盒價格昂貴、依賴進口。本研究結果表明，HPLC法和CLEIA法測定丙戊酸血藥濃度結果無需相互校正，在實際臨床治療藥物監測中可互相替代。

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