甲硝唑經皮給藥制劑的體外質量守恒研究

賈衛哺，張 嫣，李 楠

(天津大學藥物科學與技術學院現代藥物傳遞及功能高效化重點實驗室，天津 300072)

治療皮膚疾病的皮膚局部給藥制劑一般通過檢測接受液中的藥物含量來評價治療效果[1－2]，而在皮膚病灶部位的活性成分含量沒有得到檢測，故考察治療皮膚病的局部給藥制劑在相關皮膚部位的藥物分布非常重要。臨床為了增加或提高藥物的療效，經常會在處方中加入通透修飾劑[3]，一般通過經皮滲透速率來考察修飾劑對藥物的功效，研究皮膚各層中藥物含量的變化可更加詳細地了解修飾劑對活性成分在皮膚各層分布的影響。為了測定皮膚各區域的藥物的有效濃度，本研究設計了一種更適宜局部給藥制劑的體外質量守恒方法，即分別檢測藥物在皮膚表面殘留、角質層、活性表皮與真皮層和接受液中的含量。本試驗以甲硝唑[4－5]為模型藥物，分別用無毛小鼠皮和豬皮作為透皮模型，進行體外經皮滲透試驗，分別對皮膚各層進行取樣，用高效液相色譜(HPLC)法分析皮膚各層中甲硝唑的含量，并對甲硝唑經皮制劑的體外質量守恒進行方法學驗證，考察此方法的可行性和適用性。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);KQ－250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AX 200型電子天平(日本SHIMADZU公司);YB－P6型智能透皮試驗儀(天津藥典標準儀器廠);UV－2450型紫外分光光度計(日本SHIMADZU公司);ZH－3型渦旋混合儀(天津藥典標準儀器廠);高剪切勻化儀(德國Fluko公司);TGL－16G型高速離心機(上海安亭科學儀器廠);0.22 μm微孔濾膜(天津市實驗儀器設備有限公司)。甲硝唑(藥用，天津中安化工);羥丙基纖維素(Klucel?MF藥用，美國Hercules公司);甲醇(色譜純，韓國Burdick＆Jackson公司);磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉和正辛醇均為分析純(天津市江天化工有限公司);實驗用水(色譜純，天津永源純水開發公司)。無毛小鼠(天津市放射研究所動物實驗中心);豬(體重50 kg，本實驗室動物房提供)。

2 方法與結果

2.1 含量測定方法的建立

色譜柱:Thermo Hypersil C18反相柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，ODS－2);流動相:超純水－甲醇系統(75∶25)，經抽濾脫氣后使用;檢測波長:310 nm;流速:1 mL/min;柱溫:30℃;進樣量:20 μL。標準曲線為 A=62.067 C －4.883 9，r=0.999 9;線性范圍為 0.15 ～75 μg/mL。

2.2 離體皮膚的制備

將無毛小鼠斷頸、處死，用醫用剪刀小心剝離腹部與背部的皮膚，然后角質層向下，鋪平于鋪有保鮮膜的試驗臺上，輕輕去除皮下粘連物和脂肪，檢查鼠皮的完整性，不得有任何破損，用生理鹽水反復沖洗，用醫用剪刀剪成適當大小，最后置于密封袋中，置－20℃環境保存備用。每次使用前應檢查鼠皮的完整性，確保無破損方可使用。豬皮脫毛除去皮下組織，用生理鹽水反復沖洗，用醫用剪刀剪成適當大小，保存方法同鼠皮。

2.3 甲硝唑處方的制備

精密稱量一定量的甲硝唑細粉溶解于稱量好的超純水中，攪拌至甲硝唑完全溶解，將羥丙基纖維素加入溶液中，繼續攪拌至形成均一、穩定的凝膠。甲硝唑處方:每100 g含甲硝唑0.75 g，羥丙基纖維素0.75 g。

2.4 無毛小鼠離體皮膚體外透皮試驗

2.4.1 試驗方法

將預處理的無毛小鼠皮膚固定于Franz擴散池上 (角質層向上，真皮層面向接受池)，在給藥池和接受池中分別加入pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，置(32±1)℃恒溫水浴的智能透皮試驗儀中(轉速500 r/min)，平衡1 h后給藥。給藥前將平衡時的磷酸鹽緩沖溶液全部倒出，將一定量的甲硝唑處方 (給藥劑量為100 mg和50 mg，有效成分為0.75 mg和0.375 mg)置皮膚上，接受池內為 16 mL 的生理鹽水，分別于 1，2，4，8，12，16，20，24 h 時取樣，共分4部分進行質量守恒研究。

表皮殘留量(H1):用蘸滿磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)的棉球輕輕擦拭表皮10次以上，后用透明膠帶粘取皮膚表面，將棉球和透明膠帶置10 mL磷酸鹽緩沖溶液中提取，最后用微孔濾膜過濾后進行高效液相檢測。

角質層殘留量(H2):重復用透明膠帶粘取皮膚表面10次以上，直至角質層完全消失[5]，將所有膠帶放入10 mL磷酸鹽緩沖溶液中提取，最后用微孔濾膜過濾后進行高效液相檢測。

活性表皮/真皮層殘留量(H3):將剩余皮膚放入1.5 mL甲醇與1.5 mL磷酸鹽緩沖溶液中渦旋、粉碎、超聲30 min，離心10 min(6 000 r/min)，取上清液，重復3次，將上清液混合，最后用微孔濾膜過濾后進行高效液相檢測[6]。

接受液含量(H4):將接受液用微孔濾膜過濾后進行高效液相檢測。

2.4.2 甲硝唑凝膠劑經皮吸收方法學考察

回收率試驗:將甲硝唑凝膠劑按照2.4項下方法給藥，給藥劑量為100 mg與50 mg(甲硝唑有效劑量分別為0.75 mg與0.375 mg)。在不同的時間點分別取樣、檢測，分別計算出皮膚各部分中和總共回收甲硝唑的量(表皮殘留+角質層殘留+活性表皮/真皮層+接受液)并與給藥劑量進行對比，計算回收率。高低劑量給藥回收率試驗結果分別見表1和表2。根據此質量守恒方法，在給藥劑量為100 mg時回收率達到85%以上，給藥劑量為50 mg時甲硝唑回收率達到80%以上，說明此方法用于甲硝唑體外釋放研究時回收率高，檢測到的甲硝唑含量不低于80%甲硝唑給藥的有效劑量。同時可以檢測出甲硝唑在不同的時間點時皮膚中治療藥物的有效劑量，一定程度上可反映藥物的治療效果。

表1 甲硝唑體外經鼠皮試驗回收率結果(100 mg，±s，n=6)

表1 甲硝唑體外經鼠皮試驗回收率結果(100 mg，±s，n=6)

不同給藥部位檢測到的藥物含量(%)時間(h)12481 2 16 20 24 H1 66.75±1.97 53.54±1.44 42.65±0.99 23.19±0.79 13.96±0.79 7.24 ±0.94 3.04 ±1.07 2.05 ±0.85 H2 5.58±1.17 5.31±0.68 3.98±0.88 3.17±0.65 2.57±0.42 3.35±0.78 1.57±0.80 1.38±0.16 H3 17.65 ±2.01 18.35 ±1.67 16.09 ±1.46 16.84 ±0.13 14.49 ±0.90 13.08 ±0.41 11.95 ±0.77 7.73±0.13 H4 4.15 ±0.16 9.24 ±0.24 30.18±1.46 48.28±1.13 63.85±1.72 71.17±1.30 78.07±1.80 82.55±4.5合計94.17 ±2.44 86.45 ±1.45 92.61 ±2.71 91.37 ±2.60 94.81 ±1.97 94.72 ±1.28 94.54 ±1.08 93.72 ±2.13

重現性考察:對甲硝唑凝膠劑經皮給藥后分別在不同時間點(1，2，4，8，12，16，20，24 h)進行取樣分析，每組試驗重復 6 次。根據試驗數據計算相對標準偏差，不同給藥劑量時數據的 RSD均在15%以下，說明此經皮滲透方法的重現性良好。

2.5 豬皮體外透皮試驗

2.5.1 試驗方法

用豬皮驗證2.4項下提供方法的普遍性，體外透皮試驗操作過程中表皮殘留，角質層與接受液濃度的測定同2.4項下方法，因豬皮的皮膚比較厚，所以在活性表皮/真皮層檢測甲硝唑時選擇將剩余皮膚置于3 mL甲醇與3 mL磷酸鹽緩沖溶液中渦旋、粉碎、超聲30 min，離心10 min(6 000 r/min)，取上清液，重復3次，將上清液混合，最后用微孔濾膜過濾后進行高效液相檢測。

表2 甲硝唑體外經鼠皮試驗回收率結果(50 mg，±s，n=6)

表2 甲硝唑體外經鼠皮試驗回收率結果(50 mg，±s，n=6)

時間(h)不同給藥部位檢測到的藥物含量(%)1 2 4 8 1 2 16 20 24 H1 46.07±0.05 24.81±0.02 10.54±0.78 7.72±0.03 5.51±0.02 3.98±0.17 3.62±0.01 2.26±0.04 H2 8.00±0.02 5.03±0.01 5.81±0.03 3.11±0.02 2.97±0.01 1.23±0.01 1.36±0.08 0.01±0.00 H3 19.82±0.03 21.27±0.02 17.51±0.01 17.52±0.01 14.71±0.05 13.65±0.06 10.21±0.01 5.71±0.01 H4 14.25±0.03 34.94±0.02 46.87±0.01 57.73±0.04 63.45±0.03 69.25±0.03 77.01±0.04 87.67±0.04合計88.19±1.15 81.88±1.95 81.21±1.64 85.51±2.01 86.57±1.09 87.97±1.32 92.17±1.09 95.47±1.00

2.5.2 甲硝唑凝膠劑經豬皮吸收方法學考察

回收率試驗:檢測方法同2.4.2項下回收率試驗方法，給藥劑量為100 mg與50 mg時回收率結果均達到85%以上，分別見表3和表4。

表3 甲硝唑體外經豬皮試驗回收率結果(100 mg，±s，n=6)

表3 甲硝唑體外經豬皮試驗回收率結果(100 mg，±s，n=6)

時間(h)不同給藥部位檢測到的藥物含量(%)1 2 4 81 2 16 20 24 H1 75.70±1.98 60.09±1.71 54.27±3.36 31.29±0.66 24.24±1.74 13.14±0.29 8.52±0.30 4.12±0.13 H2 2.75±0.40 5.37±0.51 5.83±0.41 4.57±0.38 3.94±0.44 4.17±0.28 3.44±0.16 3.34±0.19 H3 10.20±0.65 18.65±0.66 32.38±1.91 28.21±1.66 21.62±0.46 18.36±0.71 12.65±0.36 10.88±0.46 H4 3.17±0.12 6.24±1.25 10.30±1.94 30.91±1.31 43.61±3.67 61.85±1.42 63.52±1.06 74.93±1.68合計91.91±2.49 90.35±2.37 95.22±3.80 94.32±2.46 93.40±3.87 97.52±0.95 92.33±0.88 93.27±1.89

表4 甲硝唑體外經豬皮試驗回收率結果(50 mg，±s，n=6)

表4 甲硝唑體外經豬皮試驗回收率結果(50 mg，±s，n=6)

時間(h)不同給藥部位檢測到的藥物含量(%)1 2 4 81 2 16 20 24 H1 77.81±1.30 56.90±0.85 50.25±3.97 35.43±0.58 20.78±0.37 12.68±0.41 7.69±0.44 3.78±0.36 H2 2.29±0.73 4.86±0.25 4.90±6.46 3.85±0.40 3.70±0.57 4.07±0.59 3.38±0.26 1.80±0.18 H3 10.10±0.40 18.69±1.70 32.46±1.02 24.90±0.76 21.21±0.66 17.74±0.51 12.40±0.41 11.36±1.38 H4 3.19±0.13 6.74±0.16 7.40±0.58 32.68±1.30 47.39±1.19 60.77±1.89 72.20±1.08 79.95±0.84合計93.42±1.54 87.19±2.17 95.01±5.69 96.86±2.60 96.16±2.31 95.26±2.36 95.66±0.97 96.88±2.07

重現性考察:考察過程同2.5項下重現性考察過程，每組試驗數據的 RSD均在15%以下，說明此經豬皮滲透方法的重現性也良好。

3 討論

此質量守恒方法快速、簡潔，以無毛小鼠鼠皮和豬皮分別作為透皮模型時回收率均比較高，重現性均良好，說明此方法可操作性強，具有一定普遍性，適合于不同的皮膚模型，可以廣泛適用于皮膚類藥物的體外透皮試驗。

此方法能考察藥物活性成分在皮膚各部位的滯留量與滯留時間，了解藥物在病灶部位的有效含量，為考察治療效果提供依據。通過測定不同時間點的藥物在皮膚4層中的含量和分布，同時也為經皮給藥修飾劑等研究提供了更加詳細的考察方法，考察修飾劑改變(增加或減少)藥物經皮滲透速率的同時是否也改變(增加或減少)藥物在皮膚病灶部位藥物活性成分的含量。

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