高效液相色譜法測定四乙酰葛根素的含量及有關物質＊

胡人月，張 毅，陳國慶，杜洪飛，楊大堅

(重慶市中藥研究院，重慶 400065)

葛根素在臨床上用于治療冠心病、突發性耳聾、偏頭痛及視網膜動脈或靜脈阻塞，但其在水和有機溶劑中的溶解度均較低，導致口服葛根素生物利用度極低。本課題組對葛根素進行乙酰化，制備了四乙酰葛根素(tetra－acetylated puerarin，TAP)。生物利用度試驗表明，TAP的口服生物利用度高于葛根素[1－2]。課題組進行了相關藥理試驗[3－5]，表明TAP具有開發為創制新藥的潛力。為了進一步推進該化合物的研究進程，本試驗建立了測定TAP的含量及有關物質的方法。該方法簡便、準確、專屬性強，可用于該原料藥的質量控制。

1 儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀(G1322A Degasser，G1312B Bin Pump SL，G1329B ALs SL，G1316B TLC SL);乙腈為色譜純(TEDIA，USA)，其余試劑均為分析純，水為超純水;AUW十萬分之一電子分析天平(日本島津公司);TAP 樣品(批號為 091221，100118，100308)、中間體A、中間體B和TAP對照品均由重慶市中藥研究院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent XDB －C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈 － 水(45 ∶55);流速:1.2 mL/min;檢測波長:250 nm;進樣量:5 μL;柱溫:30℃。理論板數按TAP計算不低于3 000，USP拖尾因子為1.12。

2.2 專屬性試驗

稱取TAP樣品適量，流動相配置成1 g/L的溶液，作為破壞試驗樣品貯備液。取2 mL上述貯備液，分別經過0.025 moL/L鹽酸溶液、0.025 mol/L的氫氧化鈉溶液、0.5%雙氧水溶液各2 mL(室溫)24 h和光照 24 h(照度為4 750 lx)，用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節至中性，加流動相稀釋至10 mL，經高效液相色譜儀分析測定。結果表明，各降解產物與TAP均能良好分離。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學考察

線性關系考察:取TAP對照品10.38 mg，置10 mL容量瓶中，精密稱定，加流動相配置成1.038 g/L的溶液，再逐級稀釋，分別配置成 0.020 76，0.051 9，0.083 04，0.1 038，0.124 56，0.155 7，0.186 84 g/L 的溶液，各進樣 5 μL，以峰面積(Y)為縱坐標、進樣質量濃度(X)為橫坐標作圖，得線性方程為 Y=12 871 X －24.554，r=0.999 9(n=7)。結果表明，TAP 進樣量在0.103 8 ～0.934 2 μg之間與峰面積呈良好線性關系。

檢測限和定量限試驗:用流動相將TAP對照品溶液(0.092 4 g/L)逐步稀釋，測定TAP的 S/N=3時檢測限為6.65 ng/mL，S/N=10 時定量限為 0.07 μg/mL。

精密度試驗:取TAP對照品溶液(0.0519，0.1038，0.1557g/L)，照2.1項下色譜條件分別連續進樣6次，每次5 μL。結果3個濃度溶液測定峰面積的 RSD分別為0.09%，0.17%，0.22%(n=6)，表明方法精密度良好。

重復性試驗:取6份樣品(批號為091221)，依法制備供試品溶液并測定。結果TAP平均含量為98.58%，RSD為0.17%(n=6)，表明方法重現性好。

穩定性試驗:取重復性試驗的供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時進樣，照2.1項下色譜條件進行測定。結果TAP含量的 RSD為0.11%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

加樣回收試驗:分別取TAP對照品9.24mg，TAP樣品9.98mg，置10 mL容量瓶中，精密稱定，加流動相至刻度配置成0.924 g/L的對照品貯備溶液和0.998 g/L的樣品貯備溶液。分別吸取對照品貯備溶液和樣品貯備溶液 0.4，0.5，0.6 mL 混合于 10 mL 容量瓶中各3份，加流動相至刻度作為樣品溶液;取上述對照品貯備溶液1 mL，置10 mL容量瓶中作為對照品溶液，各進樣5 μL，計算回收率。結果平均回收率為99.94%，RSD=1.32%(n=9)。

耐用性試驗:分別考察了流動相比例[乙腈－水(40∶60)、乙腈 － 水(45 ∶55)和乙腈 － 水(50 ∶50)]、色譜柱溫度(25，30，35 ℃ )、流動相流速(1.0，1.2 mL/min)，其余條件照系統適應性的條件進行試驗。結果表明，含量測定方法條件變化較小時，TAP和其他峰能很好分離且含量變化不大。

2.4 樣品測定

樣品含量測定:精密稱取TAP對照品和TAP樣品(3批)適量按系統適應性的色譜條件進行含量測定。結果批號分別為091221，100118，100308 的樣品，純度分別為 98.65，98.76，98.88。

有關物質測定:采用自身對照法測定有關物質含量。精密量取本品適量，用流動相配制成含TAP約1 g/L的溶液，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液適量，用流動相稀釋成含TAP約0.01 g/L的溶液，作為對照品溶液。取對照品溶液5 μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的20%～25%，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的3倍。再精密量取供試品溶液與對照品溶液各5 μL，分別注入液相色譜儀進行測定，結果見表1。

表1 樣品有關物質測定結果

3 討論

取TAP、中間體A和B適量，加流動相稀釋至適宜質量濃度，在200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描。結果表明，TAP、中間體A和B均在250 nm附近有最大吸收，故選擇250 nm為檢測波長。

在流動相篩選過程中，筆者設計了乙腈－水(40∶60)、乙腈－水(35∶65)、乙腈－0.02%磷酸(40∶60)等多組流動相系統。試驗結果表明，流動相為乙腈－水(45∶55)時，與其他峰能夠達到完全分離，且主峰的出峰時間合適，故選擇乙腈－水(45∶55)為流動相。

TAP在酸性、強光和氧化條件下比較穩定，在堿性條件下不穩定;降解產物結構需要在后續研究中采用液質等手段確定。

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