高效液相色譜法測定復(fù)方消渴滴丸中葛根素含量

戴 薇，張 錦

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，重慶 400010;2.重慶市藥品檢驗所，重慶 401121)

復(fù)方消渴滴丸是由葛根、苦瓜、山藥等藥材經(jīng)現(xiàn)代提取工藝制成的純中藥制劑，具有益氣養(yǎng)陰、清熱生津功效，臨床用于治療氣陰不足所致的消渴以及2型糖尿病患者。筆者采用高效液相色譜法測定該制劑中葛根素的含量，旨在探討其質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

LC－20A型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器，Autoscience溶劑過濾器，超聲波提取器;Sartorius BP211D型電子天平。葛根素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為752－200108);復(fù)方消渴滴丸(市售品，批號為 110901，110902，110903);甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－水(28∶72);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;紫外檢測波長:250 nm;進樣體積:10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取葛根素對照品 5.23 mg，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密量取2 mL，置10 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含葛根素41.84 μg 的對照品溶液。取復(fù)方消渴滴丸適量，研細，稱取 0.2 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理20 min，放冷至室溫，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例，取除葛根外的其他各味藥材，按制劑工藝制成陰性對照樣品，再按供試品溶液制備方法制備，即得陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:取2.2項下3種溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，依法測定。結(jié)果陰性對照品溶液色譜在葛根素相對保留時間處未見色譜峰，表明陰性樣品對葛根素的檢測無干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別精密吸取質(zhì)量濃度為0.202 9 g/L的對照品貯備液，分別稀釋成 83.68～836.8 μg/mL 7個系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，各進樣10 μL，記錄色譜圖，以對照品溶液質(zhì)量濃度(C)為橫坐標、峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線，得葛根素回歸方程 Y=265 572.945 5 X+289.279，r=0.999 8(n=7)。結(jié)果表明，葛根素質(zhì)量濃度在83.68～836.8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取質(zhì)量濃度為41.84 μg/mL的對照品溶液，連續(xù)依法進樣6次。結(jié)果葛根素峰面積的 RSD=1.08%(n=7)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，在上述色譜條件下分別于0，1，2，4，6，8，24 h 時依法進樣測定，結(jié)果葛根素峰面積的RSD=1.28%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批(批號為110901)樣品6份，分別制備成供試品溶液，依法進樣測定。結(jié)果葛根素含量為6.36 mg/丸，RSD=1.74%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

檢測限與定量限試驗:取對照品溶液1 mL(41.84 μg/mL)，以70%乙醇逐級稀釋后依法進樣測定。按信噪比(S/N)=3確定葛根素檢測限為0.24 μg/mL，按信噪比(S/N)=10確定葛根素定量限為 1.36 μg/mL。

加樣回收試驗:稱取已知葛根素含量的供試品約0.1 g，精密稱定，共9份，分別置25 mL容量瓶中，分別精密加入高、中、低3種量級(120%，100%，80%)的葛根素對照品溶液，按供試品溶液制備方法制得回收試驗溶液，依法進樣測定含量。計算結(jié)果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，注入液相色譜儀測定，按外標法計算樣品中葛根素含量。結(jié)果批號為110901，110902，110903，葛根素含量分別為 6.36，6.37，6.36 mg/丸。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

精密稱取葛根素對照品溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在250 nm處有最大吸收，故將250 nm波長作為檢測波長。

3.2 流動相選擇

曾參照2010年版《中國藥典(一部)》[1]葛根項下葛根素含量測定的流動相甲醇－水(25∶75)，結(jié)果葛根素色譜峰與相鄰色譜峰分離度不好，峰形較寬，對稱性不理想。經(jīng)多次試驗，篩選出流動相甲醇－水(28∶72)并進行分離，結(jié)果峰形好，理論塔板數(shù)較高。

3.3 供試品溶液制備

參照文獻[2－6]報道，樣品用70%乙醇分別超聲10，20，30 min，結(jié)果超聲20 min與超聲30 min樣品含量接近，且為比超聲10 min含量高;提取溶劑選用甲醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇，制備供試品溶液，結(jié)果以70%乙醇制備的供試品溶液中，葛根素含量較其他溶劑高，因此制備供試品溶液時樣品用70%乙醇超聲20 min即可。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:312.

[2]王金宏，李 馨，金 迪，等.感冒清熱口服液中葛根素含量測定[J].黑龍江醫(yī)藥，2010，23(1):1.

[3]王 健，魏清榕，洛 麗，等.心血寧片中葛根素含量測定方法的研究[J].中藥材，2004，27(6):446.

[4]郝建莉，孔維涵，胡 靜，等.葛根異黃酮膠囊葛根素含量測定[J].天津藥學(xué)，2007，19(4):12.

[5]周 翎，許 楓.HPLC法測定糖消片中葛根素的含量[J].遼寧中醫(yī)雜志，2007，34(2):212.

[6]高國峰，周 珩.粉葛飲片質(zhì)量標準研究[J].中國藥業(yè)，2010，19(12):47.