人Gax基因轉染對血管平滑肌細胞增殖、遷移和細胞周期的影響*

鄭 輝， 薛 松， 連 鋒， 胡振雷， 汪永義

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院心胸外科，上海200127)

冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting，CABG)是目前冠心病治療的主要手段，但是術后靜脈橋再狹窄嚴重影響了橋血管的遠期通暢率，已成為臨床上越來越棘手的問題。靜脈橋再狹窄的關鍵病變是內膜增生[1]，涉及多種因素，其中血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)過度增殖并從中膜向內膜遷移是重要的病理基礎，抑制VSMCs增殖和遷移是預防靜脈橋再狹窄發生的策略之一。隨著分子生物學及其技術的發展，基因治療逐漸成為防治靜脈橋再狹窄的焦點。生長終止特異性同源異型盒基因(growth arrest－specific homeobox gene，Gax)是近年來發現具有調節細胞生物學行為的核轉錄因子基因，屬于同源異型盒基因家族，其通過與啟動子或增強子序列相結合，激活或抑制靶基因的表達，實現細胞生長、分化和遷移的基因調控作用[2]。有研究表明Gax基因在VSMCs中的表達模式類似于gas基因(growth arrest－specific gene)、gadd基因(growth arrest and DNA damage－inducible gene)，而gas/gadd基因家族對VSMCs增殖和遷移呈負性調節，Gax(hGax)基因這種特殊的表達特性漸漸受到人們的關注，成為血管成形術后再狹窄防治的新靶點。本研究以人Gax(hGax)基因為靶點，構建其重組腺病毒載體并感染兔VSMCs，觀察hGax基因過表達對血清刺激后VSMCs增殖、遷移和細胞周期的影響，為靜脈橋再狹窄基因治療提供實驗基礎。

材料和方法

1 材料

兔血管平滑肌細胞、pEGFP－N1－hGax、大腸桿菌DH5α由本實驗室保存，pDC318－mCMV質粒和pPE3質粒由上海第二軍醫大學錢其軍教授惠贈;脂質體Lipofectamine 2000TM和Trizol均購自Invitrogen;限制性內切酶購自NEB;DMEM培養液和胎牛血清購自Gibco;Taq酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa;病毒DNA抽提試劑盒、PCR回收試劑盒和DNA片段純化試劑盒均購自Qiagen;鼠抗人Gax單克隆抗體購自Abnova;MTT購自Sigma;PI購自上海生工試劑公司;所有引物均由上海博尚生物公司合成。

2 方法

2.1 高表達hGax的腺病毒載體的構建與感染 采用限制性內切酶NheⅠ和Hind III對pEGFP－N1－hGax質粒進行雙酶切反應，將酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化hGax目的基因(片段大小為927 bp);然后將hGax基因片段與經SpeⅠ和Hind III雙酶切消化后的pDC318－mCMV質粒通過T4 DNA連接酶進行連接構建成pDC318－mCMV－hGax質粒;轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，用氨芐青霉素LB培養基平板進行篩選，孵育過夜后，挑取陽性克隆菌落，搖菌后用堿裂解法提取質粒，分別進行Hinc II和Kpn I、Sac I和Xho I雙酶切鑒定;酶切鑒定正確的克隆送至上海博尚生物技術公司進行DNA測序，將完全正確的質粒命名為pDC318－mCMV－hGax;然后將穿梭質粒pDC318－mCMV－hGax與骨架質粒pPE3通過Lipofectamine 2000TM脂質體共轉染HEK293細胞以獲得含hGax基因的復制缺陷型腺病毒載體，用病毒DNA抽提試劑盒提取腺病毒DNA，PCR法鑒定重組腺病毒載體是否含有hGax基因。hGax基因上游引物 5'－ATGGAACACCCGCTCTTTGGC －3'，下游引物 5'－ TCATAAGTGCGCATGCTCTGAG －3'。經PCR鑒定正確的重組腺病毒載體命名為Ad5－hGax，即攜帶人Gax基因的5型復制缺陷型腺病毒重組載體。經擴增、純化后用Ad5－hGax感染VSMCs，并設陰性對照組(即Ad5－EGFP感染VSMCs)和空白對照組(即PBS感染VSMCs)。

2.2 RT－PCR檢測轉染VSMCs hGax mRNA的表達 病毒感染細胞48 h后應用Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度和A260/A280值，按常規行RTPCR。引物序列:hGax正義鏈 5'－ACCACCATCACCACCATCATC－3'，反義鏈 5'－ TGGAAGAGTTGGAGCACAGG－3'，擴增序列長度為174 bp;GAPDH正義鏈5'－GAACATCATCCCTGCCTCCAC －3'，反義鏈 5'－GCCTGCTTCACCACCTTCTTG －3'，擴增序列長度為183 bp。PCR反應條件:95℃預變性3 min，95℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環，72℃ 10 min。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳、顯像、拍照。

2.3 免疫熒光染色法檢測轉染VSMCs hGax蛋白的表達 Ad5－hGax轉染VSMCs 48 h后，固定細胞并按常規免疫熒光染色方法進行，Ⅰ抗為1∶400鼠抗人Gax蛋白單克隆抗體，4℃孵育過夜后PBS洗滌。Ⅱ抗為1∶1 000 FITC標記羊抗鼠IgG，37℃避光孵育1h，PBS洗滌后置熒光顯微鏡下觀察。

2.4 Ad5－hGax轉染對血清刺激VSMCs增殖的影響 按8×103cells/well接種于96孔板，細胞貼壁后進行干預，分別加入 Ad5－hGax、Ad5－EGFP和PBS液，轉染4 h后用PBS液漂洗細胞去除病毒液，然后加入含1%FBS的 DMEM孵育12 h，換成含10%FBS的DMEM，使血清刺激VSMCs。分別于血清刺激 24 h、48 h、72 h、96 h 時，加入 20 μL MTT(5 g/L)，37℃繼續培養4 h后吸棄孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使甲瓚結晶完全溶解，酶標儀上以波長570 nm檢測各孔吸光度(A值)。抑制率(%)=(1－實驗組平均A值/空白對照組平均A值)×100%。

2.5 Ad5－hGax轉染對血清刺激VSMCs遷移的影響 取對數生長期VSMCs接種于培養皿，調整細胞濃度以致第2 d覆蓋達到約90%，實驗分組和病毒感染過程如上述，在培養皿底部做一直線標記，用無菌槍頭在無菌條件下沿標記線作劃痕，PBS液漂洗后加入含1%FBS的DMEM，孵育12 h后重新加入含10%FBS的DMEM，置37℃、5%CO2孵箱培養，分別于24 h、48 h、72 h后各組鏡下隨機選取10個視野進行拍攝，測量兩邊細胞遷移邊緣之間的距離即劃痕寬度，取均值。

2.6 Ad5－hGax轉染對血清刺激VSMCs周期的影響 將VSMCs接種于培養皿，實驗分組、病毒感染和血清刺激方法同MTT實驗部分。血清刺激72 h后，消化并收集各組細胞，用4℃ 70%乙醇固定，RNA酶37℃下消化30 min，PI避光染色，300目篩網過濾后樣本加入流式細胞儀分析細胞周期。

3 統計學處理

結 果

1 含hGax基因的復制缺陷型腺病毒重組載體的鑒定

經Sac I和 Xho I雙酶切，pDC318－mCMV－hGax質粒切出319 bp、791 bp和3 728 bp 3條片段，與預期的酶切結果完全相符，見圖1。經Hinc II和Kpn I雙酶切，pDC318－mCMV－hGax質粒切出401 bp、596 bp、1 846 bp 和1 995 bp 4 條片段，與預期結果完全相同，見圖2。DNA測序結果示pDC318－mCMV－hGax質粒中的人Gax基因序列與GenBank中公布的基因序列基本一致。PCR產物凝膠電泳圖示在927 bp的位置上出現特異性條帶，與預期的hGax基因片段大小相符，見圖3。說明成功構建了含hGax基因的復制缺陷型腺病毒重組載體。

2 RT－PCR分析

瓊脂糖凝膠電泳圖示，Ad5－hGax轉染的VSMCs中hGax mRNA表達呈陽性條帶(174 bp)，而Ad5－EGFP轉染組無相應陽性條帶，表明在mRNA水平上目的基因hGax成功轉染入VSMCs，見圖4。

Figure 1.The double digestion identification of pDC318－mCMV－ hGax.M:DNA marker;Lane 1，2:Sac I and Xho I digestion.圖1 pDC318－mCMV－hGax質粒的Sac I和Xho I雙酶切鑒定

3 免疫熒光染色分析

Ad5－hGax轉染48 h后，免疫熒光染色結果示VSMCs內呈紅色陽性表達，尤以胞核為主，即為hGax蛋白，而對照組細胞內未見相應的染色，提示VSMCs經Ad5－hGax轉染后有外源性hGax蛋白過表達，見圖5。

Figure 4.RT－PCR result of the hGax mRNA expression.M:DNA marker;Lane 1:Ad5－EGFP－transfected cells;Lane 2:Ad5－hGax－transfected cells.圖4 hGax mRNA表達的RT－PCR檢測結果

Figure 5.The hGax protein expression in the Ad5－hGax－transfected cells.A:hGax protein expression in the cells 48 h after Ad5－hGax transfection under fluorescent microscope(×100);B:EGFP protein expression in the cells 48 h after Ad5－EGFP transfection(negative control group)under fluorescent microscope(×100);C:VSMCs 48 h after PBS treatment(blank control group)under inverted microscope(×100).圖5 hGax蛋白在Ad5－hGax轉染后的細胞中表達

4 細胞增殖分析

MTT法結果表明(表1)，Ad5－hGax轉染組中血清刺激后VSMCs體外增殖受到明顯抑制，與陰性對照組和空白對照組(各時點為0)相比有顯著差異(P＜0.05)，且隨培養時間的延長細胞生長抑制率升高，見圖6，而陰性對照組和空白對照組之間無顯著差異，說明hGax基因過表達能顯著抑制血清刺激后兔VSMCs增殖。

表1 hGax蛋白對血清刺激后VSMCs增殖的影響Table 1.Effect of hGax protein expression on the proliferation of serum－induced VSMCs in different groups at different time points(±s.n=5)

表1 hGax蛋白對血清刺激后VSMCs增殖的影響Table 1.Effect of hGax protein expression on the proliferation of serum－induced VSMCs in different groups at different time points(±s.n=5)

*P＜0.05 vs blank control group and Ad5－EGFP group.

Group 24 h 48 h 72 h 96 h Blank control 0.303 ±0.033 0.350 ±0.025 0.440±0.006 0.473 ±0.012 Ad5 －EGFP 0.295 ±0.029 0.348 ±0.016 0.438 ±0.008 0.467 ±0.014 Ad5 －hGax 0.251 ±0.032 0.260 ±0.015*0.275 ±0.007*0.283 ±0.007*

Figure 6.Effect of hGax overexpression on proliferation inhibitory rates of serum－induced rabbit VSMCs at different time points.±s.n=3.*P＜0.05 vs 24 h.圖6 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs生長抑制率的影響

5 細胞遷移分析

劃痕法檢測結果顯示(表2)，0 h時劃痕寬度均為(450.81 ±7.17)μm，空白對照組中劃痕寬度在不同時點上與陰性對照組相比差異無顯著，Ad5－hGax轉染組的劃痕寬度較對照組明顯延長(P＜0.05)，即該組細胞的遷移能力顯著減弱，說明hGax基因過表達能顯著抑制血清刺激后兔VSMCs遷移。

表2 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs遷移的影響Table 2.Effect of hGax gene overexpression on the migration of serum－induced rabbit VSMCs(μm.±s.n=10)

表2 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs遷移的影響Table 2.Effect of hGax gene overexpression on the migration of serum－induced rabbit VSMCs(μm.±s.n=10)

*P＜0.05 vs blank control group and Ad5－EGFP group.

Group 24 h 48 h 72 h Blank control 265.548 ±12.498 225.582 ±7.961167.385 ±9.790 Ad5 －EGFP 260.548 ±11.498 222.582 ±8.761 164.385 ±7.790 Ad5 －hGax 361.643 ±9.730* 317.582 ±9.901*289.385 ±10.783*

6 流式細胞儀分析

流式檢測結果顯示，血清刺激72 h后，Ad5－hGax轉染組中G0/G1期VSMCs比例增高，G2/M+S期細胞減少，與空白對照組和陰性對照組相比差異顯著;而陰性對照組和空白對照組之間無顯著差異，見表3、圖7。

表3 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs細胞周期分布的影響Table 3.The effects of hGax gene overexpression on cell cycle distribution of serum－induced rabbit VSMCs(%.±s.n=3)

表3 hGax基因過表達對血清刺激后兔VSMCs細胞周期分布的影響Table 3.The effects of hGax gene overexpression on cell cycle distribution of serum－induced rabbit VSMCs(%.±s.n=3)

*P＜0.05 vs blank control group and Ad5－EGFP group.

Group G0/G1 G2/M+S Blank control 44.17 ±2.0555.83 ±2.05 Ad5 － EGFP 42.57 ±2.4557.43 ±2.45 Ad5 － hGax 66.65 ±3.75*33.35 ±3.75*

Figure 7.Effect of adenovirus－ mediated hGax gene transfection on cell cycle of induced rabbit VSMCs.圖7 Ad5－hGax轉染對血清刺激后兔VSMCs細胞周期的影響

討 論

靜脈橋再狹窄實質上是自體大隱靜脈為適應動脈循環中的壓力而發生的血管重塑。Manabe等[3]研究表明VSMCs是新生內膜的主要成分之一，其異常增殖和遷移在移植血管病理性重塑過程中起重要作用。胎牛血清作為一種復合型的營養物質，主要含有血小板源生長因子、堿性成纖維生長因子和溶血磷脂酸等成分，血小板源生長因子作為VSMCs的促絲分裂劑和趨化劑，對血管增殖性病變起重要作用[4];堿性成纖維生長因子可刺激血管內皮細胞和VSMCs增殖。本實驗應用血清刺激體外培養的VSMCs模型來模擬部分體內過程，對于防治靜脈橋再狹窄的研究具有重要意義。

同源盒基因在核苷酸序列水平上含有一段約180 bp的高度保守序列，編碼60個氨基酸，稱為同源結構域，其中含有的螺旋－轉角－螺旋結構可識別以5’－TAAT－3’為核心10～12 bp的 DNA序列，并且與DNA形成特異性結合，而其N－末端臂與DNA小溝的接觸能起到穩定結合的作用。同源盒基因編碼的蛋白通過這種結合方式對下游靶基因的表達進行調節，從而控制細胞生長、分化。Gax基因是Gorski等[5]在1993年克隆出1個主要存在于心血管系統的同源盒基因，其編碼蛋白是一種轉錄因子。除保守的同源結構域外，Gax蛋白含有特殊的CAX重復結構，其對細胞增殖和分化的調節具有重要作用。Gax基因高表達于靜止期血管內皮細胞和VSMCs。Liu等[6]研究發現血管外膜成纖維細胞正常狀態下表達Gax蛋白，并且Gax基因過表達可顯著減少S期細胞，增加G0－G1期細胞，從而抑制其增殖;經研究驗證在絲裂原刺激或血管損傷后VSMCs中的 Gax 基因表達迅速下降[5，7]，表明 Gax 基因在維持非增殖狀態VSMCs中起重要調節作用;Yamashita等[8]研究表明Gax是血管緊張素Ⅱ和C型鈉尿肽調節VSMCs增殖信號轉導通路中的共同轉錄因子，前者表現為促進VSMCs增殖，后者則抑制VSMCs增殖;此外，細胞表型轉化是血管增生性疾病中VSMC增殖和遷移的關鍵起始步驟[9]，因而維持收縮型 VSMCs顯得至關重要，Markmann等[10]報道Gax是調節VSMCs收縮型與合成型之間相互轉化的重要調節基因之一。

為明確Gax基因對血清刺激后VSMCs增殖、遷移和周期的影響，通過過表達Gax基因，檢測細胞增殖、遷移和周期的變化是可行的有效方法，這將為以Gax基因作為候選基因，進行靜脈橋再狹窄基因治療提供一定的實驗依據。同時，基于復制缺陷型腺病毒載體的優勢和對VSMCs具有高親和性[11]，作為介導血管系統的過表達載體比較理想。通過復制缺陷型腺病毒介導的Gax基因可能是靜脈橋再狹窄防治的有效方法。本研究中，通過含hGax基因復制缺陷型腺病毒過表達載體轉染 VSMCs，轉染48 h后，hGax在mRNA水平上和蛋白水平上均有顯著表達，說明轉染成功，導入的目的基因hGax在VSMCs內成功表達。

本實驗通過MTT法檢測各組血清刺激后VSMCs的增殖活性，結果顯示，Ad5－hGax轉染組中的VSMCs生長速度明顯減慢，與對照組相比具有統計學差異，并且隨著血清刺激時間的延長而降低。Gorski等[12]研究表明Gax基因可通過激活細胞周期蛋白激酶抑制劑P21活性來抑制人臍靜脈內皮細胞增殖。細胞增殖是由細胞周期控制的[13]。本實驗應用流式細胞儀檢測轉染72 h后細胞周期變化的結果顯示，Ad5－hGax轉染組中G0/G1期細胞顯著多于對照組，G2/M+S期明顯減少，統計學上差異顯著，提示Gax基因過表達可能通過細胞周期限制點使VSMCs處于靜止期來抑制細胞增殖。

本研究的劃痕實驗結果顯示hGax基因過表達可明顯抑制血清刺激后VSMCs遷移，與對照組比較有統計學差異，而陰性對照組和空白對照組之間無顯著差異。VSMCs遷移涉及細胞表型轉化、局部黏附激酶、細胞骨架蛋白等多種因素。Witzenbichler等[14]研究發現 Gax 基因通過抑制整合素 αγβ3、αγβ5表達來調節化學趨化因子誘導的 VSMCs遷移。但是Gax基因對VSMCs遷移抑制效應所通過的信號轉導通路目前尚無定論，仍需更深一步研究。

總之，本研究將含hGax基因的重組腺病毒載體感染兔VSMCs，獲得過表達hGax基因的VSMCs。通過對細胞增殖、遷移和細胞周期的研究發現:腺病毒介導的hGax基因過表達能有效抑制血清刺激后VSMCs的增殖和遷移;這可能通過阻滯細胞周期進展來實現。

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