過氧化物酶體增殖物激活受體δ對同型半胱氨酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)的影響及機(jī)制*

宋歡歡， 徐尚華△， 黃茂芝， 許昌聲， 謝良地

(1福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院心內(nèi)科，福建南平353000;2福建省高血壓研究所，福建福州350004)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種炎癥性、免疫性疾病。單核細(xì)胞趨化蛋白 1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP－1)可募集血液中的單核細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下，同時(shí)促進(jìn)血管內(nèi)膜炎性反應(yīng)，參與動脈粥樣硬化起始過程。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性心絞痛、血管痙攣、急性冠脈綜合癥病人血漿MCP－1表達(dá)增高;阻斷MCP－1可以阻止血管早期炎癥反應(yīng)[1－2]。在動脈粥樣硬化、糖尿病等心血管和代謝性疾病中，氧化應(yīng)激致細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增高，參與血管炎癥過程[3－4]。研究發(fā)現(xiàn)，MCP－1的釋放加速動脈粥樣硬化過程中活性氧的產(chǎn)生[5]。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)是AS的一個(gè)新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究表明，AS患者血清Hcy水平明顯高于正常人，且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[6－7]。過氧化物酶體增殖物激活受體 δ(peroxisome proliferator activated receptor δ，PPARδ)是一類依賴配體激活的核激素受體，屬于類固醇受體超家族。PPARδ不但是脂肪酸代謝的一個(gè)重要調(diào)節(jié)者，而且研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥、動脈粥樣硬化中也發(fā)揮重要作用[8－10]。本研究通過觀察 PPARδ 激活后對Hcy誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)表達(dá)MCP－1的影響并探討其機(jī)制。為動脈粥樣硬化，尤其是伴有高同型半胱氨酸血癥的動脈粥樣硬化等心血管和代謝紊亂疾病提供潛在的治療靶點(diǎn)。

材料和方法

1 主要試劑及儀器

M199細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、0.1%Ⅰ型膠原酶、0.25%胰酶－EDTA(Gibco);二氧化碳培養(yǎng)箱(Napco);倒置相差熒光顯微鏡(Olympus);Hcy、GW0742、DPI干粉(Sigma);RT－PCR試劑盒、Tag酶(Fermentas);Trizol試劑、瓊脂糖(Invitrogen);PPARδ抗體(Abcam);β－actin抗體(Santa Cruz);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(中杉金橋公司);vWF抗體(Dako);山羊抗兔IgG－R(Santa Cruz);活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司);硝酸纖維素膜(Millipore);紫外分光光度計(jì)(上海儀器廠);PCR擴(kuò)增儀(Bioneer);高速低溫離心機(jī)(Beckman);系列凝膠成像系統(tǒng)(Vilber Lourmat);水平瓊脂糖電泳槽、DYCZ－24DN型 雙垂直電泳儀、DYCP－40C型半干式碳板轉(zhuǎn)印儀和DYY－III－6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 細(xì)胞消化及培養(yǎng) 在無菌條件下，取健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)后新鮮的胎兒臍帶15～20 cm(標(biāo)本來自福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)，低溫保存于M199培養(yǎng)基中，4 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞消化分離。采用膠原酶消化法分離HUVECs，于超凈臺內(nèi)在臍靜脈一端插入16號針頭并以止血鉗固定，用37℃預(yù)熱的PBS沖洗至無血跡，用另一把止血鉗夾住臍帶的另一端，注入預(yù)熱的0.1%Ⅰ型膠原酶10～15 mL至臍靜脈充盈飽滿，室溫消化15 min;用不含F(xiàn)BS的M199培養(yǎng)液沖洗1遍，將消化液收集入15 mL無菌離心管，1 500 r/min離心10 min;棄上清，用含20%FBS的M199完全培養(yǎng)液吹打成細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況每2～3 d換液，用第2代或第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞鑒定 取1代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片，待細(xì)胞鋪滿80%左右，PBS洗滌3次;用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次;在含0.5%Triton X －100的PBS中孵育20 min，PBS洗滌3次;1%BSA室溫封閉30 min，Ⅰ抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次;Ⅱ抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次;熒光顯微鏡下觀察。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 取2～3代細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞鋪滿80%左右，換用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化，實(shí)驗(yàn)分為對照組、Hcy組、GW0742(PPARδ特異激動劑)組和二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI，NAPDH 氧化酶特異抑制劑)組;先加入 GW0742(終濃度 10－6mol/L)、DPI(終濃度10－5mol/L)，30 min 后加入 Hcy(終濃度 10－3mol/L)作用24 h后處理細(xì)胞(每次實(shí)驗(yàn)每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次)。

2.4 RT－PCR檢測目的基因 采用Trizol試劑一步法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測濃度后，按RT－PCR說明書操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，后加PCR Mix及相應(yīng)引物擴(kuò)增MCP－1、PPARδ及GAPDH。MCP－1上游引物5'－ATGAAAGTCTCTGCCGCC －3'，下游引物 5'－TTGCTTGTCCAGGTGGTC －3'，290 bp;PPARδ 上游引物 5'－ACGCTATCCGTTTGGTCG －3'，下游引物 5'－CTCACGGGTGACAAAGCC －3'，524 bp;內(nèi)參照(GAPDH)上游引物5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC － 3'，下游引物 5'－ TCCACCACCTGTTGCCTGTA －3'，454 bp。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min;PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析其吸光度值，目的基因和內(nèi)參照的吸光度比值作為mRNA的相對表達(dá)量。

2.5 Western blotting檢測 PPARδ蛋白表達(dá) 以預(yù)冷PBS洗滌干預(yù)細(xì)胞2次，添加了PMSF和蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液于冰上裂解細(xì)胞5 min，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞并收集至1.5 mL的離心管中，超聲振蕩，按上樣緩沖液和蛋白4∶1混合，100℃水浴5 min;12 000 r/min離心5 min，取上清－80℃冰箱保存。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;加入Ⅰ抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min;再加HRP標(biāo)記的Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;發(fā)光劑ECL盒顯色反應(yīng)。用凝膠圖像分析所得電泳圖的平均吸光度值。

2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS初級熒光測定 用24孔培養(yǎng)板干預(yù)細(xì)胞，按 ROS檢測試劑盒說明，取 130 μL Genmed染色液(Reagent B)至15 mL離心管，加入12.870 mL Genmed稀釋液(Reagent C)，混勻后，標(biāo)記為Genmed染色工作液，避光37℃保存;然后抽去24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，沿著孔壁各孔加入500 μL Genmed染色工作液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20 min;抽出Genmed染色工作液，沿著孔壁各加入500 μL 37℃預(yù)熱的 Genmed 保存液(Reagent D)，倒置熒光顯微鏡觀察，拍照。用Image－Pro Plus對熒光圖片進(jìn)行分析，計(jì)算吸光度，吸光度越高，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平越高。以空白對照組的吸光度為基準(zhǔn)值(100)，計(jì)算每組細(xì)胞的ROS相對水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 HUVECs 鑒定

vWF因子免疫熒光發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)激發(fā)出紅色熒光，即呈陽性反應(yīng)，見圖1。

Figure 1.Red fluorescence was observed in the cytoplasm of HUVECs under fluorescent microscope(×400).圖1 熒光顯微鏡下HUVECs細(xì)胞質(zhì)激發(fā)出紅色熒光

2 Hcy對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)的影響

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈濃度依賴性促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞 MCP－1 mRNA表達(dá)，Hcy濃度為10－5mol/L時(shí)，與空白對照組相比，MCP－1 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Effect of Hcy on the mRNA expression of MCP－1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.圖2 Hcy對HUVECs MCP－1 mRNA表達(dá)的影響

3 Hcy對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA表達(dá)的影響

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈濃度依賴性降低人內(nèi)皮細(xì)胞 PPARδ mRNA表達(dá)，Hcy濃度為 10－5mol/L時(shí)，與空白對照組相比，PPARδ mRNA表達(dá)顯著降低 (P＜0.01)，見圖3。

4 GW0742和DPI對Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MCP－1 mRNA的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與Hcy組相比，GW0742組和DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)都顯著降低(P＜0.01)，見圖4。

5 GW0742和DPI對Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PPARδ mRNA的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與Hcy組相比，DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;GW0742組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ mRNA顯著增高(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 3.Effect of Hcy on the mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.圖3 Hcy對HUVECs PPARδ mRNA表達(dá)的影響

Figure 4.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of MCP －1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;##P＜0.01 vs Hcy group.圖4 GW0742和DPI對Hcy誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)MCP－1 mRNA的影響

6 GW0742和DPI對Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)PPARδ蛋白的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與Hcy組相比，DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GW0742組人內(nèi)皮細(xì)胞PPARδ蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，見圖6。

Figure 5.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10－3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖5 GW0742和 DPI對 Hcy誘導(dǎo) HUVECs表達(dá)PPARδ mRNA的影響

Figure 6.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced protein expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖6 GW0742和DPI對Hcy誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)PPARδ蛋白的影響

7 GW0742和DPI對Hcy誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內(nèi)皮細(xì)胞ROS熒光信號增強(qiáng);與Hcy組相比，GW0742組和DPI組人內(nèi)皮細(xì)胞ROS熒光信號減弱，見圖7。

Figure 7.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced production of ROS in HUVECs(×400).Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖7 GW0742和DPI對Hcy誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS的影響

討 論

血漿Hcy的增高和一些代謝紊亂疾病包括動脈粥樣硬化等密切相關(guān)。HHcy被認(rèn)為是AS的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。陶碩秋等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Hcy通過NADPH氧化酶介導(dǎo)ROS途徑，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子－1(vascular cell adhesion molecule－1，VCAM－1)而參與AS的發(fā)病過程。MCP－1募集的單核細(xì)胞參與AS的起始過程。研究指出，血液中MCP－1增高可增加冠心病人急性心梗和死亡發(fā)生率[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy呈濃度依賴性地促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)。Hwang等[13]在高蛋氨酸飼養(yǎng)大鼠發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟MCP－1表達(dá)增加，同時(shí)腎小球硬化增加。由此可見，Hcy引起的MCP－1表達(dá)增高在HHcy引起的AS過程中發(fā)揮重要作用。

動脈粥樣硬化過程中，氧化應(yīng)激致細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)增高[3]。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Hcy在促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)增高的同時(shí)還增加了細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放，而DPI抑制Hcy促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)ROS水平。我們的結(jié)果表明，ROS參與Hcy誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1表達(dá)的過程。

我們的研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，Hcy可抑制人內(nèi)皮細(xì)胞 PPARδ mRNA 和蛋白的表達(dá)。Lee 等[14－15]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠炎癥因子表達(dá)增高的同時(shí)，而PPARδ表達(dá)下降。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活后可以抑制Hcy誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA的表達(dá);Zingarelli等[16]在研究小鼠敗血癥模型時(shí)發(fā)現(xiàn)PPARδ表達(dá)減弱，而小鼠全身性炎癥因子的釋放增加，這種反應(yīng)在應(yīng)用PPARδ激動劑時(shí)得到改善。楊大春等[17]在研究心肌梗死重構(gòu)大鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活后可以通過抑制炎癥因子基質(zhì)金屬蛋白酶－9表達(dá)，從而改善梗死心肌重塑。這表明PPARδ可以通過抑制炎癥因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活在抑制Hcy誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA表達(dá)的同時(shí)，降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，而應(yīng)用DPI也可抑制Hcy誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1mRNA的表達(dá)，提示PPARδ激活可能是通過ROS途徑抑制MCP－1的表達(dá)，從而起到抗動脈粥樣硬化作用。而 Fan等[18]研究表明，PPARδ可通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放抗氧化應(yīng)激機(jī)制抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)。但其具體作用機(jī)制仍需更深入的研究。

總之，我們發(fā)現(xiàn)，Hcy可以誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1 mRNA的表達(dá)及ROS的產(chǎn)生，而PPARδ激活后抑制這些作用，其可能是通過NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS途徑發(fā)揮抗炎作用。PPARδ有望成為動脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)。

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