丹參酮ⅡA對(duì)豚鼠肥厚心肌延遲整流鉀通道的影響*

唐 昱， 盛國(guó)太， 葛郁芝， 王云霞， 曹乾強(qiáng)， 周裔忠， 張繁之

(1江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，2江西省心血管病研究所，江西南昌330006)

肥厚心臟不僅表現(xiàn)在心臟結(jié)構(gòu)的改變，還可存在明顯的電生理特性改變，因此，探究心肌中其主導(dǎo)地位的鉀離子通道間的相互作用，在認(rèn)識(shí)心肌細(xì)胞電生理和進(jìn)行心律失常治療方面具有重大意義［1］。丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參的水溶性衍生物，具有抑制血小板黏附聚集、抗血栓形成、改善微循環(huán)、抗心肌缺血缺氧等功效，臨床上主要用于冠心病的治療，而有關(guān)抗心律失常作用的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究丹參酮ⅡA對(duì)肥厚心肌細(xì)胞快激活延遲整流鉀電流(the rapidly activating component of the delayed rectifier K+current，IKr)和慢激活延遲整流鉀電流(the slowly activating component of the delayed rectifier K+current，IKs)的影響，旨在從離子通道水平探討丹參酮ⅡA的抗心律失常作用機(jī)制，為肥厚心肌心律失常的防治提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物與試劑 60只健康雄性豚鼠，體質(zhì)量250～300 g(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(武漢生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)為080520)，纈沙坦(北京諾華制藥有限公司)。

1.2 儀器 彩色多普勒超聲診斷儀(惠普公司);倒置顯微鏡(北京科樂(lè)公司);膜片鉗儀微電極(上海奧爾科特生物科技有限公司);電極拉制儀(華科大儀博生命科學(xué)儀器有限公司);Axopatch 200B膜片鉗放大器(Axon);DigiData 1200B型數(shù)/模(或模/數(shù))轉(zhuǎn)換器(Axon)。

1.3 溶液配制 (1)臺(tái)式液(mmol/L):NaCl 136、KCl 5.4、MgCl21.0、NaH2PO40.33、CaCl21.8、HEPES 10、glucose 10，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.4。配制時(shí)不加CaCl2即為無(wú)鈣臺(tái)氏液。(2)KB液(mmol/L):KCl 40、KH2PO425、MgSO43.0、KOH 80、L－谷氨酸 50.3、牛磺酸 20、HEPES 10、glucose 10、EGTA 0.5，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.4。記錄IKr時(shí)的細(xì)胞外液即為臺(tái)氏液。(3)記錄IKs時(shí)的細(xì)胞外液(mmol/L):NaCl 135、KCl 3.0、MgCl21.0、NaH2PO40.33、CaCl21.8、HEPES 10、glucose 10，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.4。(4)電極內(nèi)液(mmol/L):天門冬氨酸鉀120、KCl 20、HEPES 5、MgCl21.0、K2－ATP 4、EGTA 10、磷酸肌酸二鈉2.0，用KOH調(diào)pH到7.3。

2 方法

2.1 模型制作 分離腹主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈后，在腎動(dòng)脈上方約1 cm處的腹主動(dòng)脈，用7號(hào)注射針頭緊貼腹主動(dòng)脈，平行放置，結(jié)扎，抽出注射針頭逐層縫合肌肉及皮膚。其中12只行假手術(shù)，分離腹主動(dòng)脈后不結(jié)扎。

2.2 血壓的測(cè)量 將實(shí)驗(yàn)豚鼠裝入固定盒內(nèi)固定，尾部通過(guò)加壓套插入至接近尾根部，使鼠尾剛好處于脈搏傳感器的“脈搏信號(hào)傳感片”上方，調(diào)節(jié)鼠尾壓迫片使傳感片緊貼鼠尾下方的尾動(dòng)脈，待脈搏穩(wěn)定后進(jìn)行血壓測(cè)量。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式 12只行假手術(shù)的豚鼠為假手術(shù)組(A組)。48只成功建立心肌肥厚模型的豚鼠在術(shù)后4周隨機(jī)分為4組:未治療的肥厚模型組(B組)、低劑量丹參酮ⅡA組(10 mg·kg－1·d－1，C 組)、高劑量丹參酮ⅡA 組(20 mg·kg－1·d－1，D 組)和纈沙坦組(10 mg·kg－1·d－1，E 組)，每組各12只。給藥方式:采用腹腔注射，其中未治療的肥厚模型組和假手術(shù)組分別以等體積的蒸餾水腹腔注射。

2.4 心肌細(xì)胞分離 藥物干預(yù)8周后，開(kāi)胸行在體主動(dòng)脈插管，在通氧(95%O2，5%CO2)和保持37℃恒溫的條件下進(jìn)行Langendorff灌流。用無(wú)鈣臺(tái)氏液［KCl 5.5、MgCl20.4、NaCl 140、NaH2PO40.33、HEPES 5、glucose 5.5(pH 7.4，NaOH)］逆行灌流3 ～5 min(壓力70 mmHg)，再用含0.4 g/L I型膠原酶、0.2 g/L蛋白酶 E、0.25 g/L小牛血清蛋白和80 μmol/L Ca2+的臺(tái)氏液循環(huán)灌流15 min后，然后用無(wú)鈣Tyrode液沖洗。剪去心房，用無(wú)酶的無(wú)鈣液終止酶解后取心室肌稱重，計(jì)算心室/體重比率(ventricle/weight ratio，VWR);再將心室肌在 KB液(KCl 40、KOH 70、KH2PO420、MgCl23、HEPES 10、EGTA 0.5、glucose 10、L－glumatic acid 50及 0.5%牛血清白蛋白)中室溫留置2 h備用。

2.5 膜片鉗全細(xì)胞記錄 選取紋理清晰、桿狀和大小適中的細(xì)胞在室溫下(22～25℃)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗進(jìn)行電生理數(shù)據(jù)收集。微電極經(jīng)垂直拉制儀拉制而成，充灌電極內(nèi)液后使電極阻抗保持在2～5 MΩ。采用微電極操縱器將電極緩慢推向細(xì)胞，同時(shí)給電極加約10 cmH2O正壓，當(dāng)電極貼緊細(xì)胞膜后給電極加10～20 cmH2O負(fù)壓，吸引數(shù)秒鐘使電極尖端與細(xì)胞膜表面形成1 GΩ以上高阻封接，信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗放大器放大。在電流穩(wěn)定后開(kāi)始記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。記錄的電流值以電流密度(pA/pF)表示以消除細(xì)胞間誤差。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 各實(shí)驗(yàn)組血壓測(cè)定

建立心肌肥厚模型組4周后測(cè)定血壓，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組血壓(123±8)mmHg相比較，各手術(shù)模型組的血壓波動(dòng)于(160±10)mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各手術(shù)模型組間血壓無(wú)顯著差異(P ＞0.05)。

2 肥厚心肌病理生理改變

與A組相比，B、C、D和E組心室重量/體重比(ventricular weight/body weight，VW/BW)、左心室重量(left ventricular weight，LVM)和左室游離壁厚度(left ventricular free wall，LVFW)均升高(P ＜0.01);與B組相比，C、D和E組VW/BW、LVM和LVFW下降(P ＜0.01)，見(jiàn)表1。

3 各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞電生理變化

與A組相比，B組動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)明顯延長(zhǎng);而 C、D、E組的心肌細(xì)胞APD較肥厚組明顯縮短(P＜0.01);與A組相比，B組膜電容(membrane capacitance，MC)增加;而與B組相比，C組、D和E組的心肌細(xì)胞MC降低(P＜0.01)，見(jiàn)表 2。

表1 各實(shí)驗(yàn)組左心室重量、左室游離壁厚度和心室重量/體重的比較Table 1.The LVM，LVFW and VW/BW in each experimental group(±s.n=12)

表1 各實(shí)驗(yàn)組左心室重量、左室游離壁厚度和心室重量/體重的比較Table 1.The LVM，LVFW and VW/BW in each experimental group(±s.n=12)

＊＊P＜0.01 vs group A;##P ＜0.01 vs group B.A:control;B:model;C:tanshinone ⅡA 10 mg·kg－1·d－1;D:tanshinoneⅡA 20 mg·kg－1·d－1;E:valsartan 10 mg·kg－1·d－1.

Group LVM(g) LVFW(mm)VM/BW(mg/g)A 3.9 ±0.1 4.8 ±0.1 3.0 ±0.3 B 8.1 ±0.2＊＊ 7.1 ±0.3＊＊ 4.8 ±0.2＊＊C 6.4 ±0.1## 5.6 ±0.6## 3.6 ±0.4##D 6.1 ±0.3## 5.5 ±0.4## 3.5 ±0.3##E 6.5 ±0.2## 5.8 ±0.4## 3.4 ±0.6##

表2 各實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)作電位時(shí)間和膜電容變化Table 2.The action potential duration and membrane capacitance in each experimental group(±s.n=12)

表2 各實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)作電位時(shí)間和膜電容變化Table 2.The action potential duration and membrane capacitance in each experimental group(±s.n=12)

##P ＜0.01 vs group A;△△P ＜0.01 vs group B.

Group APD25(ms) APD50(ms) APD75(ms) APD90(ms) MC(pF)A 6.2 ±0.1 15.8 ±2.4 20.4 ±4.6 38.6 ±2.9 246 ±17 B 16.9 ±1.8## 75.7 ±3.0## 90.3 ±10.5## 123.7 ±12.8## 391 ±14##C 9.2 ±0.4△△ 20.8 ±3.6△△ 43.2 ±3.7△△ 50.8 ±7.9△△ 279 ±10△△D 7.1 ±0.3△△ 17.6 ±2.5△△ 31.3 ±4.0△△ 40.6 ±4.2△△ 258 ±11△△E 9.4 ±0.3△△ 20.2 ±1.9△△ 40.1 ±5.8△△ 51.2 ±6.4△△ 280 ±16△△

4 IKr及其尾電流 IKr－tail的測(cè)定

為排除干擾電流的影響，細(xì)胞外液中加入5 μmol/L硝苯地平 (ICa－L，特異性阻斷劑)和 30 μmol/L二乙酰醇293B(IKs特異性阻斷劑)以阻斷Ica－L和 IKs。鉗制電位(holding potential，HP)為－50 mV，去極化至－10 mV，5 000 ms的去極化脈沖，分別記錄各實(shí)驗(yàn)組的IKr及IKr－tail電流(n=5)。與A組相比較，B 組 IKr及 IKr－tail電流均增強(qiáng)，而 C、D 和 E 組IKr及 IKr－tail電流比 B 組顯著降低(P ＜0.05)，C、D、E組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖1、表3。

5 IKs及其尾電流 IKs－tail的測(cè)定

細(xì)胞外液中加入 5 μmol/L 硝苯地平(ICa－L，特異性阻斷劑)和100 μmol/L多菲利特(IKr特異性阻斷劑)以阻斷ICa－L和IKr。從－40 mV去極化至 +80 mV，5 000 ms的去極化脈沖，分別記錄各實(shí)驗(yàn)組的IKs及 IKs－tail電流(n=5)。與 A 組相比較，B 組 IKs及IKs－tail電流均增強(qiáng)，C、D 和 E 組心肌細(xì)胞 IKs及 IKs－tail比B組顯著降低(P＜0.05)，見(jiàn)圖2、表3。

討 論

Figure 1.The IKrchanges of cardiomyocytes in each experimental group.圖1 各實(shí)驗(yàn)組IKr的變化

心肌肥厚是心肌細(xì)胞對(duì)各種內(nèi)在和外在刺激引起的負(fù)荷過(guò)重的一種適應(yīng)和代償性反應(yīng)。當(dāng)負(fù)荷超過(guò)一定界限時(shí)，心臟結(jié)構(gòu)、功能和離子通道均可發(fā)生變化，不僅心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)成分發(fā)生改變，還可導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜上多種跨離子電流的異常改變，其APD延長(zhǎng)，誘發(fā)嚴(yán)重的心律失常和心源性猝死［2－3］。本研究通過(guò)結(jié)扎腹主動(dòng)脈制作心肌肥厚模型，證實(shí)肥厚心肌LVM、LVFW和VM/BW升高，APD明顯延長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。

Figure 2.The IKschanges of cardiomyocytes in each experimental group.圖2 各實(shí)驗(yàn)組IKs的變化

表3 各實(shí)驗(yàn)組IKr、IKs及其尾電流的變化Table 3.The changes of IKr，IKs，IKr－tailand IKs－tail in each experimental group(pA/pF.±s.n=12)

表3 各實(shí)驗(yàn)組IKr、IKs及其尾電流的變化Table 3.The changes of IKr，IKs，IKr－tailand IKs－tail in each experimental group(pA/pF.±s.n=12)

*P ＜0.05 vs group A;△P ＜0.05 vs group B.

Group IKr IKr－tail IKs I Ks－tail A 1.28 ±0.09 1.49 ±0.20 5.98 ±1.09 0.69 ±0.14 B 1.89 ±0.10* 2.14 ±0.16* 11.59 ±1.11* 1.13 ±0.13*C 1.45 ±0.12△ 1.71 ±0.19△ 7.85 ±1.05△ 0.88 ±0.13△D 1.39 ±0.11△ 1.67 ±0.14△ 7.76 ±1.04△ 0.81 ±0.12△E 1.46 ±0.13△ 1.73 ±0.20△ 7.87 ±1.08△ 0.90 ±0.16△

心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的形成是細(xì)胞膜上多種離子通道順序開(kāi)關(guān)綜合作用的結(jié)果，任何離子通道電流的異常均可影響正常動(dòng)作電位的形成，導(dǎo)致各種心律失常的發(fā)生［5］。IKr是鉀通道基因編碼的延遲整流鉀電流的快成分，開(kāi)放時(shí)間非常短，而關(guān)閉的時(shí)間則相對(duì)較長(zhǎng)，對(duì)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位2相平臺(tái)期的終止及3相復(fù)極化具有重要的意義［6］。IKs是動(dòng)作電位復(fù)極的重要組成部分，其基因表達(dá)異常可使得外向復(fù)極電流減少，細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)［7］。IKr和IKs對(duì)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位平臺(tái)期和復(fù)極化具有重要意義［8－9］。研究表明，病變心肌 IKr和 IKs明顯增強(qiáng)，可由折返機(jī)制形成快速性心律失常，易發(fā)生心室纖顫，增加心源性猝死的危險(xiǎn)性。本實(shí)驗(yàn)觀察到與假手術(shù)組相比較，肥厚心肌IKs和IKs及其尾電流均增大，具有致心律失常性離子通道病變的基礎(chǔ)［10］。

心肌鉀離子通道在電生理學(xué)研究方面取得了許多新進(jìn)展，人們開(kāi)始懷疑鉀離子通道能否成為抗心律失常藥物有益的作用靶點(diǎn)。于鋒等［11］采用L－甲狀腺素誘發(fā)豚鼠心肌病模型，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿明顯阻斷肥厚心肌細(xì)胞中異常增大的IKr和IKs，為藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了有利的依據(jù)。中醫(yī)藥學(xué)具有我國(guó)的傳統(tǒng)和特色，人們?cè)陂L(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)許多中藥具有抗心律失常及潛在的預(yù)防猝死作用。丹參酮IIA是中藥丹參的提取物，具有異搏停L型鈣通道阻斷作用，清除自由基，抗動(dòng)脈粥樣硬化，降低心肌耗氧量，抑菌和抗腫瘤等作用［12］。王照華等［13］報(bào)道丹參酮能夠在抗心肌肥厚的同時(shí)通過(guò)減少ICa和恢復(fù)Ito鉀離子通道的活性，起到預(yù)防心律失常的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA和纈沙坦都能顯著縮短肥大心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制肥厚心肌細(xì)胞上增大的IKr和IKs電流密度。但不同劑量丹參酮之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本實(shí)驗(yàn)觀測(cè)的時(shí)點(diǎn)有關(guān)，具體還需要深入研究加以證實(shí)。心肌動(dòng)作電位形成是多種離子通道共同參與的過(guò)程，決定復(fù)極過(guò)程的時(shí)程通道電流，主要有Ito、ICa、IKr和 IKs等。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示丹參酮對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程的影響，可能比較復(fù)雜，可能通過(guò)多通道阻斷整合發(fā)揮作用。研究表明血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑如纈沙坦等藥物可通過(guò)降低上游損失從而減輕與心肌重構(gòu)和跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)異常等相關(guān)的離子通道病［14］。但是丹參酮ⅡA是否通過(guò)類似的機(jī)制的對(duì)肥厚心肌動(dòng)作時(shí)程的整合作用，有待進(jìn)一步研究。

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