聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶調節癲癇大鼠海馬組織凋亡誘導因子及炎癥因子的研究*

王勝軍， 趙秀鶴， 劉學伍， 張同霞， 陳學蘭， 遲兆富△

(山東大學齊魯醫院1神經內科，2藥劑科，山東濟南250012)

聚腺苷二磷酸核糖［poly(adenosine diphosphate ribose)，PAR］廣泛存在于細胞中，參與細胞DNA的修復及基因組穩定［1］。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(adenosine diphosphate ribose)polymerase，PARP］和聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶［poly(adenosine diphosphate ribose)glycohydrolase，PARG］是細胞內聚腺苷二磷酸核糖基化［poly(ADP－ribosyl)ation］的重要調節酶［1］，細胞內PAR通常由PARP利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成，然后被PARG迅速降解為腺苷二磷酸核糖。在心力衰竭、腦缺血再灌注及神經元興奮毒性損傷等過程中，都發現PARP過度激活，PAR合成增加，伴有NAD耗竭，細胞死亡信號激活，炎癥因子表達等，最終發生細胞死亡［2－5］。

癲癇發作可引起海馬神經元死亡及炎癥反應，而癲癇發作的反復發生也很可能與之有關［6］。我們發現，癲癇大鼠海馬組織中PARP被過度活化，并通過激活凋亡誘導因子(apoptosis－inducing factor，AIF)及炎癥因子等造成神經元損傷［4－5］。近來研究提示，PARG參與調節PAR代謝，抑制PARG活性可減少NAD+消耗，減少炎癥因子表達和細胞凋亡，具有一定的神經保護作用［7－8］。但到目前為止，PARG是否參與癲癇發作引起的神經元損傷仍未見報道，相關分子機制亦不清楚。本研究將應用海藻氨酸(kainic acid，KA)誘發的癲癇大鼠模型，探討PARG與癲癇后海馬神經元損傷及AIF、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、白細胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)表達的關系。

材料和方法

1 材料

成年雄性Wistar大鼠，質量(250±50)g，由山東大學實驗動物中心提供。KA、PARP抑制劑3－氨基苯甲酰胺(3－aminobenzamide，3－AB)和 PARG抑制劑單寧酸(gallotannin，GT)購自 Sigma，抗 PAR多克隆抗體購自Alexis Biochemichals，抗AIF單克隆抗體、抗TNF－α單克隆抗體、抗IL－1β多克隆抗體、抗β－actin單克隆抗體、抗組蛋白H1單克隆抗體和HRP標記Ⅱ抗購自Santa Cruz，細胞色素C氧化酶IV亞基(cytochrome C oxidase subunit IV，COX－IV)多克隆抗體購自Biovision。

2 動物模型的制作

腹腔注射苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉實驗大鼠，在立體定位儀上，用微量注射器將KA(0.5 μg溶于1 μL生理鹽水中)緩慢注射入大鼠側腦室(前囟后0.85 mm，側旁 1.5 mm，深 4.3 mm)，應用腦電圖機描記顳葉(前囟后4 mm，左、右側旁 2 mm)腦電，并觀察大鼠行為變化。對照組采用等量生理鹽水代替KA。藥物干預組大鼠在注射KA 30 min前后都給予腹腔注射3－AB 40 mg/kg或單寧酸30 mg/kg。對照組亦采用等量生理鹽水代替相應藥物。

3 動物分組

實驗(一):癲癇發作后PAR表達的研究，24只大鼠隨機分為對照組、KA致癇6 h組(KA 6h)、KA致癇+3－氨基苯甲酰胺干預組(KA+3－AB)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT);實驗(二):單寧酸對癲癇后海馬神經元保護的研究，18只大鼠隨機分為對照組、KA致癇72 h組(KA 72h)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT);實驗(三):單寧酸調節AIF的研究，18只大鼠隨機分為對照組、KA致癇24 h組(KA 24h)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT);實驗(四):單寧酸調節炎癥因子表達的研究，18只大鼠隨機分為對照組、KA致癇24 h組(KA 24h)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT)。

4 大鼠海馬組織Nissl染色及組織學分析

大鼠經10%水合氯醛腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后取腦。組織浸蠟包埋，連續冠狀切片，切片厚度為10 μm，保存備用。石蠟切片脫蠟至水，1%甲苯胺藍室溫下染色，乙醇分色，二甲苯透明，中性樹膠封片。在 Olympus顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1和CA3區神經元的形態及其分布。海馬神經元計數定義為海馬CA1和CA3區每0.5 mm長度錐體細胞層中神經元數目。每張切片隨機觀察5個視野，取其平均值。

5 海馬組織蛋白提取及Western blotting

各實驗組大鼠快速斷頭取腦，快速分離海馬，緩沖液洗滌，加入細胞裂解液，冰上孵育，離心后棄上清;沉淀中加入裂解緩沖液，冰浴充分研磨，靜置離心;或于沉淀中加入細胞核裂解液或線粒體分離介質，冰上孵育后離心，上清為核蛋白提取液，沉淀物為線粒體蛋白。加入蛋白上樣液，沸水煮，－20℃冰箱保存備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別配置不同濃度的分離膠和濃縮膠，加入電泳緩沖液，將40 μg蛋白質樣品加入樣品孔的底部，在恒壓下電泳約60 min;將電泳凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙置于轉膜槽，于恒流中電轉2 h;將硝酸纖維素膜放入濃度為5%脫脂牛奶中，室溫振蕩2 h;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入合理稀釋后的Ⅰ抗溶液中4℃過夜;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入合理稀釋后的Ⅱ抗溶液中室溫振蕩1 h;洗滌后，將化學發光液試劑均勻涂于硝酸纖維素膜，放入X光片夾中于暗室曝光;將X光片顯影、定影;應用數字凝膠成像系統拍照，將目的蛋白條帶的灰度值與內參照的灰度值做比較，計算相對灰度值。

6 統計學處理

結 果

1 實驗大鼠行為學和腦電圖變化

對照組大鼠術后無抽搐發作行為，KA致癇各組在注射KA 15 min內出現咀嚼、點頭等面頸部肌肉的抽搐及單側或雙側前肢、后肢陣攣樣運動。對照組大鼠腦電圖表現為基礎波，KA致癇大鼠腦電圖描記到陣發性或叢集性高幅多棘、多尖波。單寧酸干預組大鼠與KA致癇組大鼠行為學及腦電圖未表現出明顯差別，見圖1。

Figure 1.Features of electroencephalogram in different experimental rats.A:slow waves in control group rats;B:rapid waves with high frequency charges in KA treatment rats;C:rapid waves with high frequency charges in gallotannin and KA treatment rats.圖1 各組實驗大鼠腦電圖特征

2 PARG調節癲癇大鼠PAR表達

對照組大鼠海馬組織核蛋白中PAR表達較低(0.04±0.01)，KA致癇6 h組大鼠海馬組織中的PAR表達顯著增加(0.24±0.03)(P＜0.05);PARP抑制劑3－AB干預組中PAR表達減少(0.13±0.02)，PARG抑制劑單寧酸干預組中 PAR水平(0.36±0.04)顯著增高(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of gallotannin(GT)on PAR expression in rat hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖2 單寧酸對癲癇發作大鼠海馬PAR表達的影響

3 抑制PARG減輕癲癇大鼠海馬神經元損傷

Nissl染色顯示，海馬CA1和CA3區錐體神經元存活數目KA致癇72 h組(46.13±5.12和63.34±8.11)較對照組(86.25±8.67和125.36±13.74)明顯減少(P＜0.05)。KA+GT干預組(67.75±7.58和95.84±10.92)存活神經元數目較KA致癇組顯著增加(P＜0.05)，見圖3。

4 抑制PARG減少癲癇大鼠海馬線粒體AIF的核轉位

對照組大鼠海馬組織核蛋白中僅可檢測到微弱的AIF表達(0.09±0.02)，KA致癇24 h組大鼠海馬組織核蛋白中的AIF的含量明顯增加(0.69±0.11，P＜0.05)，單寧酸干預以后，核蛋白中AIF含量顯著減少(0.35±0.08);與之對應，KA致癇24 h組大鼠海馬組織線粒體蛋白中的AIF的含量(0.31±0.06)較對照組(1.12±0.14)減少(P＜0.05)，單寧酸干預以后，線粒體蛋白中 AIF含量(0.76±0.11)較KA致癇24 h組增加(P＜0.05)，見圖4。

Figure 3.Gallotannin attenuated hippocampal cell death after seizures(Nissl staining，× 200).A，C，E:CA3 subfield;B，D，F:CA1 subfield.A，B:control;C，D:KA;E，F:KA+GT.圖3 單寧酸減少癲癇大鼠海馬神經元的死亡

Figure 4.Effect of GT on AIF translocation from mitochondria to nucleus in hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖4 單寧酸對癲癇大鼠海馬線粒體AIF細胞核轉位的作用

5 抑制PARG減少癲癇大鼠海馬組織中IL－1β和TNF－α蛋白的表達

對照組大鼠海馬組織中僅有較弱的IL－1β和TNF－α蛋白表達(0.12±0.02和0.17±0.02)，KA致癇24 h組大鼠海馬中的IL－1β和TNF－α蛋白的表達(0.95±0.11和0.93±0.13)明顯增加(P＜0.05);單寧酸干預后，IL－1β和TNF－α蛋白表達(0.45±0.07和0.39±0.07)明顯降低(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Effect of GT on IL－1β and TNF－α protein expression in hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖5 單寧酸對癲癇大鼠海馬IL－1β與TNF－α表達的作用

討 論

聚腺苷二磷酸核糖基化是細胞內一種重要的蛋白修飾方式，PARP催化合成不同分子量的PAR以共價鍵方式與靶蛋白結合，參與DNA修復、細胞凋亡、炎癥反應等生理過程［1］。目前，PARP介導的細胞死亡也被稱為parthanatos(PARP－1－mediated cell death)，被認為是不同于壞死、凋亡、自嗜的細胞死亡形式，它與AIF從線粒體釋放移位到細胞核有關［9］。我們先前的研究也證實了調節AIF信號通路是PARP抑制劑在癲癇致神經損傷過程中發揮保護作用的重要機制之一［5］。目前，PAR被認為是調節parthanatos的重要信號分子，在細胞核內合成的PAR可轉移到細胞漿作用于線粒體從而誘發AIF的釋放。最新研究發現，AIF蛋白本身不僅含有DNA結合位點，還含有PAR結合的特異性位點，若PAR結合位點喪失，AIF蛋白則不再被PARP調節［10］。

PARG在細胞中存在110 kD和60 kD 2種異構體，前者主要表達于細胞核，與PARG活性關系密切［11］。研究發現，抑制PARG活性具有一定的細胞保護作用，這很可能與減慢細胞PAR降解速度，減少細胞能量消耗有關［8］。此外，PARG還參與調節細胞內鈣離子水平，而細胞內鈣信號與AIF介導的細胞死亡密切相關［1］。最新的研究發現，PARG可調節瞬時受體電位通道2引起的細胞鈣超載及AIF介導的細胞死亡［12］。抑制PARG能降低細胞內二磷酸腺苷核糖水平，阻斷瞬時受體電位通道2介導的細胞鈣信號及AIF核轉位，最終減輕細胞的損傷［12］。不過也有研究發現，細胞敲除PARG基因后，DNA損傷加重，在紫外線損傷下發生 AIF介導的細胞死亡［13］。本研究提示，PARG抑制劑單寧酸可顯著減輕癲癇發作造成的大鼠海馬神經元損傷，而且單寧酸的神經保護作用部分與阻斷AIF信號通路有關。

癲癇發作可引起腦組織出現明顯的炎癥反應，腦內注射針對IL－1β受體拮抗劑表現出明顯的抗驚厥及神經元保護作用，炎癥因子被認為與癲癇的發生頻率、神經元存活及膠質細胞增生關系密切［6，14］。研究已證實，PARP 可調節 IL－1β、TNF－α等核轉錄因子κB依賴性的基因轉錄［2］。我們的研究也發現，抑制PARP活性可減少癲癇大鼠海馬組織核轉錄因子κB相關的IL－1β和環氧化酶2的表達［4］。另外，研究也提示PARG參與調節炎癥反應，在脊髓損傷中，抑制PARG可抑制白細胞浸潤及多種炎癥因子的表達［7］。PARG抑制劑單寧酸可調節激活蛋白1及分裂原活化蛋白激酶介導的炎癥信號［15］。本研究也提示，單寧酸可調節癲癇大鼠海馬組織IL－1β、TNF－α表達，這很可能也是其發揮神經保護作用的重要機制之一。

總之，本研究發現，PARG參與大鼠癲癇致神經元損傷過程，單寧酸可明顯減輕癲癇后大鼠海馬神經元損傷，參與調節AIF由線粒體向細胞核的轉位及IL－1β、TNF－α的表達，提示PARG很可能是參與癲癇致神經元損傷的重要機制之一。

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