聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬組織凋亡誘導因子及炎癥因子的研究*

王勝軍， 趙秀鶴， 劉學伍， 張同霞， 陳學蘭， 遲兆富△

(山東大學齊魯醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2藥劑科，山東濟南250012)

聚腺苷二磷酸核糖［poly(adenosine diphosphate ribose)，PAR］廣泛存在于細胞中，參與細胞DNA的修復及基因組穩(wěn)定［1］。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(adenosine diphosphate ribose)polymerase，PARP］和聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶［poly(adenosine diphosphate ribose)glycohydrolase，PARG］是細胞內(nèi)聚腺苷二磷酸核糖基化［poly(ADP－ribosyl)ation］的重要調(diào)節(jié)酶［1］，細胞內(nèi)PAR通常由PARP利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成，然后被PARG迅速降解為腺苷二磷酸核糖。在心力衰竭、腦缺血再灌注及神經(jīng)元興奮毒性損傷等過程中，都發(fā)現(xiàn)PARP過度激活，PAR合成增加，伴有NAD耗竭，細胞死亡信號激活，炎癥因子表達等，最終發(fā)生細胞死亡［2－5］。

癲癇發(fā)作可引起海馬神經(jīng)元死亡及炎癥反應，而癲癇發(fā)作的反復發(fā)生也很可能與之有關［6］。我們發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠海馬組織中PARP被過度活化，并通過激活凋亡誘導因子(apoptosis－inducing factor，AIF)及炎癥因子等造成神經(jīng)元損傷［4－5］。近來研究提示，PARG參與調(diào)節(jié)PAR代謝，抑制PARG活性可減少NAD+消耗，減少炎癥因子表達和細胞凋亡，具有一定的神經(jīng)保護作用［7－8］。但到目前為止，PARG是否參與癲癇發(fā)作引起的神經(jīng)元損傷仍未見報道，相關分子機制亦不清楚。本研究將應用海藻氨酸(kainic acid，KA)誘發(fā)的癲癇大鼠模型，探討PARG與癲癇后海馬神經(jīng)元損傷及AIF、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、白細胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)表達的關系。

材料和方法

1 材料

成年雄性Wistar大鼠，質(zhì)量(250±50)g，由山東大學實驗動物中心提供。KA、PARP抑制劑3－氨基苯甲酰胺(3－aminobenzamide，3－AB)和 PARG抑制劑單寧酸(gallotannin，GT)購自 Sigma，抗 PAR多克隆抗體購自Alexis Biochemichals，抗AIF單克隆抗體、抗TNF－α單克隆抗體、抗IL－1β多克隆抗體、抗β－actin單克隆抗體、抗組蛋白H1單克隆抗體和HRP標記Ⅱ抗購自Santa Cruz，細胞色素C氧化酶IV亞基(cytochrome C oxidase subunit IV，COX－IV)多克隆抗體購自Biovision。

2 動物模型的制作

腹腔注射苯巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉實驗大鼠，在立體定位儀上，用微量注射器將KA(0.5 μg溶于1 μL生理鹽水中)緩慢注射入大鼠側(cè)腦室(前囟后0.85 mm，側(cè)旁 1.5 mm，深 4.3 mm)，應用腦電圖機描記顳葉(前囟后4 mm，左、右側(cè)旁 2 mm)腦電，并觀察大鼠行為變化。對照組采用等量生理鹽水代替KA。藥物干預組大鼠在注射KA 30 min前后都給予腹腔注射3－AB 40 mg/kg或單寧酸30 mg/kg。對照組亦采用等量生理鹽水代替相應藥物。

3 動物分組

實驗(一):癲癇發(fā)作后PAR表達的研究，24只大鼠隨機分為對照組、KA致癇6 h組(KA 6h)、KA致癇+3－氨基苯甲酰胺干預組(KA+3－AB)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT);實驗(二):單寧酸對癲癇后海馬神經(jīng)元保護的研究，18只大鼠隨機分為對照組、KA致癇72 h組(KA 72h)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT);實驗(三):單寧酸調(diào)節(jié)AIF的研究，18只大鼠隨機分為對照組、KA致癇24 h組(KA 24h)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT);實驗(四):單寧酸調(diào)節(jié)炎癥因子表達的研究，18只大鼠隨機分為對照組、KA致癇24 h組(KA 24h)、KA致癇+單寧酸干預組(KA+GT)。

4 大鼠海馬組織Nissl染色及組織學分析

大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉，4%多聚甲醛灌注固定后取腦。組織浸蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，切片厚度為10 μm，保存?zhèn)溆谩Ｊ炃衅撓炛了?%甲苯胺藍室溫下染色，乙醇分色，二甲苯透明，中性樹膠封片。在 Olympus顯微鏡下，觀察大鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)及其分布。海馬神經(jīng)元計數(shù)定義為海馬CA1和CA3區(qū)每0.5 mm長度錐體細胞層中神經(jīng)元數(shù)目。每張切片隨機觀察5個視野，取其平均值。

5 海馬組織蛋白提取及Western blotting

各實驗組大鼠快速斷頭取腦，快速分離海馬，緩沖液洗滌，加入細胞裂解液，冰上孵育，離心后棄上清;沉淀中加入裂解緩沖液，冰浴充分研磨，靜置離心;或于沉淀中加入細胞核裂解液或線粒體分離介質(zhì)，冰上孵育后離心，上清為核蛋白提取液，沉淀物為線粒體蛋白。加入蛋白上樣液，沸水煮，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞郾０纺z電泳，分別配置不同濃度的分離膠和濃縮膠，加入電泳緩沖液，將40 μg蛋白質(zhì)樣品加入樣品孔的底部，在恒壓下電泳約60 min;將電泳凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙置于轉(zhuǎn)膜槽，于恒流中電轉(zhuǎn)2 h;將硝酸纖維素膜放入濃度為5%脫脂牛奶中，室溫振蕩2 h;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入合理稀釋后的Ⅰ抗溶液中4℃過夜;洗滌后，將硝酸纖維素膜放入合理稀釋后的Ⅱ抗溶液中室溫振蕩1 h;洗滌后，將化學發(fā)光液試劑均勻涂于硝酸纖維素膜，放入X光片夾中于暗室曝光;將X光片顯影、定影;應用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)拍照，將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參照的灰度值做比較，計算相對灰度值。

6 統(tǒng)計學處理

結 果

1 實驗大鼠行為學和腦電圖變化

對照組大鼠術后無抽搐發(fā)作行為，KA致癇各組在注射KA 15 min內(nèi)出現(xiàn)咀嚼、點頭等面頸部肌肉的抽搐及單側(cè)或雙側(cè)前肢、后肢陣攣樣運動。對照組大鼠腦電圖表現(xiàn)為基礎波，KA致癇大鼠腦電圖描記到陣發(fā)性或叢集性高幅多棘、多尖波。單寧酸干預組大鼠與KA致癇組大鼠行為學及腦電圖未表現(xiàn)出明顯差別，見圖1。

Figure 1.Features of electroencephalogram in different experimental rats.A:slow waves in control group rats;B:rapid waves with high frequency charges in KA treatment rats;C:rapid waves with high frequency charges in gallotannin and KA treatment rats.圖1 各組實驗大鼠腦電圖特征

2 PARG調(diào)節(jié)癲癇大鼠PAR表達

對照組大鼠海馬組織核蛋白中PAR表達較低(0.04±0.01)，KA致癇6 h組大鼠海馬組織中的PAR表達顯著增加(0.24±0.03)(P＜0.05);PARP抑制劑3－AB干預組中PAR表達減少(0.13±0.02)，PARG抑制劑單寧酸干預組中 PAR水平(0.36±0.04)顯著增高(P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2.Effect of gallotannin(GT)on PAR expression in rat hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖2 單寧酸對癲癇發(fā)作大鼠海馬PAR表達的影響

3 抑制PARG減輕癲癇大鼠海馬神經(jīng)元損傷

Nissl染色顯示，海馬CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元存活數(shù)目KA致癇72 h組(46.13±5.12和63.34±8.11)較對照組(86.25±8.67和125.36±13.74)明顯減少(P＜0.05)。KA+GT干預組(67.75±7.58和95.84±10.92)存活神經(jīng)元數(shù)目較KA致癇組顯著增加(P＜0.05)，見圖3。

4 抑制PARG減少癲癇大鼠海馬線粒體AIF的核轉(zhuǎn)位

對照組大鼠海馬組織核蛋白中僅可檢測到微弱的AIF表達(0.09±0.02)，KA致癇24 h組大鼠海馬組織核蛋白中的AIF的含量明顯增加(0.69±0.11，P＜0.05)，單寧酸干預以后，核蛋白中AIF含量顯著減少(0.35±0.08);與之對應，KA致癇24 h組大鼠海馬組織線粒體蛋白中的AIF的含量(0.31±0.06)較對照組(1.12±0.14)減少(P＜0.05)，單寧酸干預以后，線粒體蛋白中 AIF含量(0.76±0.11)較KA致癇24 h組增加(P＜0.05)，見圖4。

Figure 3.Gallotannin attenuated hippocampal cell death after seizures(Nissl staining，× 200).A，C，E:CA3 subfield;B，D，F(xiàn):CA1 subfield.A，B:control;C，D:KA;E，F(xiàn):KA+GT.圖3 單寧酸減少癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的死亡

Figure 4.Effect of GT on AIF translocation from mitochondria to nucleus in hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖4 單寧酸對癲癇大鼠海馬線粒體AIF細胞核轉(zhuǎn)位的作用

5 抑制PARG減少癲癇大鼠海馬組織中IL－1β和TNF－α蛋白的表達

對照組大鼠海馬組織中僅有較弱的IL－1β和TNF－α蛋白表達(0.12±0.02和0.17±0.02)，KA致癇24 h組大鼠海馬中的IL－1β和TNF－α蛋白的表達(0.95±0.11和0.93±0.13)明顯增加(P＜0.05);單寧酸干預后，IL－1β和TNF－α蛋白表達(0.45±0.07和0.39±0.07)明顯降低(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5.Effect of GT on IL－1β and TNF－α protein expression in hippocampus after seizures.±s.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs KA.圖5 單寧酸對癲癇大鼠海馬IL－1β與TNF－α表達的作用

討 論

聚腺苷二磷酸核糖基化是細胞內(nèi)一種重要的蛋白修飾方式，PARP催化合成不同分子量的PAR以共價鍵方式與靶蛋白結合，參與DNA修復、細胞凋亡、炎癥反應等生理過程［1］。目前，PARP介導的細胞死亡也被稱為parthanatos(PARP－1－mediated cell death)，被認為是不同于壞死、凋亡、自嗜的細胞死亡形式，它與AIF從線粒體釋放移位到細胞核有關［9］。我們先前的研究也證實了調(diào)節(jié)AIF信號通路是PARP抑制劑在癲癇致神經(jīng)損傷過程中發(fā)揮保護作用的重要機制之一［5］。目前，PAR被認為是調(diào)節(jié)parthanatos的重要信號分子，在細胞核內(nèi)合成的PAR可轉(zhuǎn)移到細胞漿作用于線粒體從而誘發(fā)AIF的釋放。最新研究發(fā)現(xiàn)，AIF蛋白本身不僅含有DNA結合位點，還含有PAR結合的特異性位點，若PAR結合位點喪失，AIF蛋白則不再被PARP調(diào)節(jié)［10］。

PARG在細胞中存在110 kD和60 kD 2種異構體，前者主要表達于細胞核，與PARG活性關系密切［11］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PARG活性具有一定的細胞保護作用，這很可能與減慢細胞PAR降解速度，減少細胞能量消耗有關［8］。此外，PARG還參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子水平，而細胞內(nèi)鈣信號與AIF介導的細胞死亡密切相關［1］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，PARG可調(diào)節(jié)瞬時受體電位通道2引起的細胞鈣超載及AIF介導的細胞死亡［12］。抑制PARG能降低細胞內(nèi)二磷酸腺苷核糖水平，阻斷瞬時受體電位通道2介導的細胞鈣信號及AIF核轉(zhuǎn)位，最終減輕細胞的損傷［12］。不過也有研究發(fā)現(xiàn)，細胞敲除PARG基因后，DNA損傷加重，在紫外線損傷下發(fā)生 AIF介導的細胞死亡［13］。本研究提示，PARG抑制劑單寧酸可顯著減輕癲癇發(fā)作造成的大鼠海馬神經(jīng)元損傷，而且單寧酸的神經(jīng)保護作用部分與阻斷AIF信號通路有關。

癲癇發(fā)作可引起腦組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應，腦內(nèi)注射針對IL－1β受體拮抗劑表現(xiàn)出明顯的抗驚厥及神經(jīng)元保護作用，炎癥因子被認為與癲癇的發(fā)生頻率、神經(jīng)元存活及膠質(zhì)細胞增生關系密切［6，14］。研究已證實，PARP 可調(diào)節(jié) IL－1β、TNF－α等核轉(zhuǎn)錄因子κB依賴性的基因轉(zhuǎn)錄［2］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，抑制PARP活性可減少癲癇大鼠海馬組織核轉(zhuǎn)錄因子κB相關的IL－1β和環(huán)氧化酶2的表達［4］。另外，研究也提示PARG參與調(diào)節(jié)炎癥反應，在脊髓損傷中，抑制PARG可抑制白細胞浸潤及多種炎癥因子的表達［7］。PARG抑制劑單寧酸可調(diào)節(jié)激活蛋白1及分裂原活化蛋白激酶介導的炎癥信號［15］。本研究也提示，單寧酸可調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬組織IL－1β、TNF－α表達，這很可能也是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的重要機制之一。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，PARG參與大鼠癲癇致神經(jīng)元損傷過程，單寧酸可明顯減輕癲癇后大鼠海馬神經(jīng)元損傷，參與調(diào)節(jié)AIF由線粒體向細胞核的轉(zhuǎn)位及IL－1β、TNF－α的表達，提示PARG很可能是參與癲癇致神經(jīng)元損傷的重要機制之一。

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