角質細胞生長因子促進大鼠胰腺導管上皮細胞體外增殖

吳 剛，張曉健，白 光

(遼寧醫學院附屬第一醫院肝膽外科，遼寧錦州121000)

胰腺導管上皮細胞(pancreatic ductal epithelial cells，PDECs)可在適宜的條件下增殖分化為胰島素分泌細胞，是胰島移植治療糖尿病(diabetes mellitus，DM)的理想種子細胞。但是，目前還沒有一套良好的PDECs培養增殖的實驗方案，實現PDECs體外大量增殖成為亟待解決的問題。角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一種能特異性促進上皮細胞增殖的生長因子［1－5］，對多種器官具有保護作用，并且在損傷修復過程中大量表達，可通過促進有絲分裂、激活信號通路及調節酶活性等方面促進上皮細胞增殖和遷移作用。本實驗以大鼠胰腺組織為材料，建立一種良好有效的PDECs培養增殖方法，并探討不同濃度的KGF在體外對大鼠PDECs增殖的影響，尋找解決胰島供體短缺的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠20只，6～7周齡，雌雄不限，體質量250～300 g，遼寧醫學院動物實驗中心提供［SYXK(遼)2009-0004］。

1.2 主要試劑

KGF、DTZ、V型膠原酶和 CK19單克隆抗體(Sigma公司);Hank's液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培養基、DMEM/F12培養基(1∶1)和FBS(Gibco公司);DMSO、DAB酶底物顯色試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)。

1.3 原代PDECs的分離、純化和培養

所有大鼠術前禁食12 h，禁水4 h。采用逆行膽管灌注膠原酶法獲得細胞。采用不連續密度梯度離心法、差速貼壁法純化細胞。將部分細胞懸液移入非黏附培養瓶中培養，加入無血清的高糖DMEM/F12培養基(50 μg/L霍亂毒素、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 g/L ITS);另將部分細胞培養于放置有蓋玻片的培養皿中，行細胞鑒定。

1.4 免疫細胞化學染色法鑒定細胞表面標志物

收集6孔板中的蓋玻片(蓋玻片上接種有第4代細胞，正處于對數生長期)，PBS(pH=7.4)沖洗，4%多聚甲醛固定，經標準的滲透化處理(0.1%tritonx-100)室溫10 min，50 μL正常動物非免疫血清封閉，一抗為50 μL的小鼠抗大鼠CK19單克隆抗體(1∶100)，4℃過夜。二抗為50 μL羊抗小鼠抗體(1∶50)，37℃孵育30 min。蘇木素復染，脫水，中性樹膠封固。

1.5 RT-PCR檢測細胞表面標志

提取細胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RT-PCR檢測Nestin、CK19、Insulin和Glucagon的表達。引物設計序列(表1)。

1.6 PDECs向胰島素分泌細胞的分化

將第2～3代細胞轉入含有低糖培養基的細胞培養瓶中，培養4～6 d。取誘導分化物3 mL，加入

表1 引物設計序列Table 1 Sequence of primer

配制好的終濃度為140 mg/L的DTZ溶液5 μL，輕輕振蕩混勻，室溫下靜止6～10 min，倒置顯微鏡下觀察。分別消化誘導分化前后的細胞，1×105個/mL濃度接種于24孔板。待細胞貼壁生長后，吸凈培養液，加入1 mL含2.8 mmol/L糖的D-Hank's液置于培養箱中培養2 h，收集上清液凍存待測基礎胰島素水平;而后加入含16.7 mmol/L糖的D-Hank's液培養1 h，收集上清液采用放射免疫法(RIA法)測定分化前后兩種細胞不同糖濃度刺激下胰島素釋放含量。

1.7 不同濃度的KGF對PDECs增殖的影響

消化80% ～90%匯合生長的PDECs，制成細胞懸液，調整細胞濃度為4×105個/L，以100 μL/孔接種于96孔培養板，共3個板，5%CO237℃下培養。分為5組，1～4組加入KGF，使其終濃度分別為5、10、15和20 μg/L;第5組加入等量的 DMEM/F12 作為陰性對照組。每組4個復孔，另設一空白對照組(僅加培養液，不加細胞)，比色時用于調零。繪制KGF促進胰腺導管上皮細胞生長增殖曲線。

1.8 統計學分析

全部數據均用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。數據采用均數±標準差(±s)表示，實驗組與對照組之間比較采用t檢驗，組間采用方差分析進行兩兩比較。

2 結果

2.1 原代PDECs的分離、純化和培養

圖1 分離培養的胰腺導管上皮細胞Fig 1 PDECs morphology(×100)

膠原酶灌注胰腺后充盈良好，胰腺各部分膨脹均勻。倒置顯微鏡下觀察可見原代細胞中大量圓形細胞懸浮，細胞形態不一，呈梭形、三角形、楔形等(圖1A)。48 h后胰腺導管上皮細胞開始貼壁，呈多型性，并逐漸分裂生長為單層細胞，細胞逐漸融合為“鵝卵石樣”結構排列，細胞形態趨向一致(圖1B)。通過差速貼壁法及改用無血清培養基培養4 d內，細胞增長緩慢，從第5天開始增殖加速，進入對數生長期，細胞逐漸呈多角形，形態單一，并逐漸匯合成片。培養第10天開始呈上皮細胞樣生長，11～13 d左右細胞達80%貼壁(圖1C)。

2.2 免疫細胞化學染色檢測細胞表面標志物

蓋玻片上的單層上皮細胞胞質染色呈棕色，CK19染色陽性率達到(92.4±2.8)%(圖2)。

圖2 免疫細胞化學染色顯示胰腺導管上皮細胞表達CK19Fig 2 Expression of CK19 of PDECs by immunocytochemical stain(×100)

2.3 RT-PCR檢測細胞表面標志物

PDECs的 Nestin和 CK19表達陽性，而 Insulin及Glucagon表達陰性(圖3)。

2.4 PDECs向胰島素分泌細胞的分化

圖3 RT-PCR檢測細胞表面標志物的表達Fig 3 Expression of cell surface marker by RT-PCR

PDECs經低糖培養基誘導分化后，上皮樣細胞周圍出現大量圓形細胞，并逐漸聚集成細胞團，懸浮于培養液中。在倒置顯微鏡下觀察細胞團呈現圓形或橢圓形，稱為類胰島樣結構，經DTZ染色后細胞團呈紅色或猩紅色(圖4)。

圖4 胰腺導管上皮細胞經低糖培養基誘導分化為類胰島樣結構Fig 4 PDECs were induced to differentiate into islet-like cells(×100)

10、20和30mmol/L糖濃度下，分化后細胞胰島素釋放量顯著高于分化前(P＜0.01)(表2)。

表2 分化前后細胞對不同濃度糖溶液的胰島素反應能力Table 2 Reaction of PDECs to insulin of different glucose concentrations before and after differention(x ± s，n=8)

2.5 不同濃度的KGF對PDECs增殖的影響

培養基中加入KGF后，MTT法測定不同濃度KGF對PDECs增殖的影響(表3)。

培養2 d時，20 μg/L組細胞數顯著高于對照組;6～10 d時，10、15 和20 μg/L組細胞數顯著高于對照組(P＜0.01);第12天，20 μg/L組細胞數顯著高于對照組(P＜0.05)。倒置顯微鏡下觀察20 μg/L組PDECs均存活，形態正常，細胞密度大，增殖活躍。

3 討論

目前尚無特異的 PDECs標志物。CK19是PDECs生長發育過程中的重要因子，被認為是PDECs向干細胞轉化的標志之一［6－8］。本實驗通過免疫細胞化學染色法對第2代導管上皮細胞進行了鑒定，結果發現CK19染色陽性率在90%左右，說明分離的細胞可以表達胰腺干細胞的表面標志，而且RT-PCR結果也顯示CK19 mRNA表達陽性。Nestin是否是PDECs的表面標志物還需進一步的研究。本實驗僅在基因水平檢測到第2代細胞有Nestin表達。

胰腺細胞包括內分泌、外分泌及導管上皮細胞;其中腺泡細胞占82%，胰島細胞僅占1%。為了排除胰島細胞的污染，本研究應用RT-PCR檢測Insulin和Glucagon的表達，結果顯示分離出的細胞為較純的PDECs，可以作為后續實驗的細胞來源。

為了檢測分化出的細胞能否分泌胰島素，本研究設計了不同糖濃度的培養基，用放免法測定分化前后胰島素分泌水平。結果發現，分化前的PDECs基本無分泌胰島素的能力，分化后的類胰島樣細胞團對不同糖濃度均有反應能力。從表3可以看出，0～20 μg/L的范圍內，在同一時間下，隨著KGF濃度的增大，A值逐漸增加，且各組間有差異，說明KGF的增殖作用在本實驗所選擇的劑量范圍內呈濃度依賴性，各濃度組刺激2 d后細胞的增殖最為旺盛。

KGF是一個特異性的促上皮細胞增殖的高效生長因子，對多種器官具有保護作用，在損傷修復過程中大量表達，可通過促進有絲分裂、激活信號通路及調節酶活性等方面促進上皮細胞增殖和遷移作用［9－10］。利用不同濃度的KGF刺激大鼠胰腺導管上皮細胞的增殖，結果顯示:培養0～2 d細胞處于潛伏增殖期，細胞增殖活性在各組變化較小;第6天細胞增殖加速，進入對數生長期，6～10 d細胞計數達高峰，KGF各濃度組細胞數顯著高于對照組。第12天細胞增殖到達平臺期，細胞生長逐漸趨向停滯，但20 μg/L組細胞數仍顯著高于對照組，而其他各組細胞數與對照組比較無差異。所以在本實驗的劑量范圍內，20 μg/L為促進增殖的最佳濃度，該結果或許可為相似研究工作提供參考。

表3 MTT法測定不同濃度KGF對PDECs增殖的影響Table 3 Effects of KGF on cell proliferation shown by MTT(x ± s，n=5)

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