齊墩果酸對抗小鼠胰島細胞糖脂毒性和凋亡促進胰島素分泌

張?之，程路峰，張東輝，張 燕，毛新民，李學軍

(1.新疆醫(yī)科大學?基礎醫(yī)學院藥理教研室;2.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院;3.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆烏魯木齊830011;4.北京大學醫(yī)學部，北京100191)

齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，臨床上用為保肝藥，是女貞子、石榴等許多中藥的活性成分之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)OA具有改善糖耐量、保護糖尿病腎臟、激動PPARγ，激活酪氨酸磷酸酶Shp2等作用，可能是一個有潛力的抗糖尿病的天然物質(zhì)［1-5］，齊墩果酸降糖作用可能與其能促進胰島素分泌有關［6］。但對其在長期糖脂毒狀態(tài)下對胰島細胞的作用未見報道。本實驗觀察了OA在高糖脂毒環(huán)境下對原代培養(yǎng)胰島細胞分泌功能的影響，并從其對胰島細胞增殖與凋亡的影響探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

齊墩果酸、雙硫棕、臺盼藍、噻唑藍(MTT)和胰蛋白酶(Sigma公司);Annexin-FITC/PI雙染試劑盒(Invetrogene公司);胰島素放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術研究所);DMEM完全培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco公司);格列苯脲(Glibenclamide，天津太平洋制藥公司)，棕櫚酸(palmitic acid，PA)，碘乙酸均為CP級。

1.2 小鼠原代胰島細胞培養(yǎng)

參照參考文獻［7］等方法，經(jīng)形態(tài)學鑒定、活力及生物學功能鑒定合格后，備用。

1.3 胰島素分泌功能測定

將胰島細胞數(shù)調(diào)整為2×105～5×105個/mL，每孔加胰島細胞懸液1.0 mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，分別加入低糖(5.6 mmol/L葡萄糖)，高糖脂(30 mmol/L葡萄糖+0.5 mmol/L棕櫚酸)，高糖脂+陽性對照格列苯脲(25 mg/L)，高糖脂+不同濃度OA(5、10和20 mg/L)進行培養(yǎng)，每組4復孔，2和5 d后吸取培養(yǎng)液上清，用放射免疫法測定胰島素含量。

1.4 胰島細胞增殖活力測定

培養(yǎng)良好的胰島細胞用胰蛋白酶消化成含2×104～5×104個/mL的單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，低糖、高糖脂及藥物不同濃度干預組每組各設5復孔，并設不含細胞只含培養(yǎng)液的空白調(diào)零孔，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2和5 d后，每孔加入20 μL 5 g/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)后加入200 μL二甲基亞砜，使結晶物溶解均勻，酶標儀490 nm處測定吸光度。

1.5 胰島細胞凋亡測定

將生長良好的胰島細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，分別加低糖、高糖脂及藥物+高糖脂培養(yǎng)基2 mL，每組設3個復孔，干預6 d后收集細胞，冷PBS洗，洗后細胞再離心，棄上清重懸細胞用1×Annexin-binding緩沖液稀釋至1×106個/mL，加入AV，PI室溫避光孵育15 min，樣品置冰上盡快用流式細胞儀530 nm檢測熒光發(fā)射。

1.6 統(tǒng)計學分析

SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，AVON單因素方差分析后進行多組間均數(shù)比較。

2 結果

2.1 齊墩果酸對高糖脂培養(yǎng)胰島細胞胰島素分泌的作用

高糖脂培養(yǎng)2 d胰島素分泌降低，5 d時顯著低于正常低糖培養(yǎng)組(P＜0.01)，5 mg/L OA干預2 d胰島素分泌明顯高于高糖脂組，20 mg/L OA干預組在第5天胰島素分泌顯著高于高糖脂組(P＜0.05)(表1)。

表1 OA對高糖脂培養(yǎng)胰島細胞insulin分泌功能的影響Table 1 Effects of OA on insulin secretion of islet cell under glucose and fat cultivation(x ± s，n=4)

2.2 齊墩果酸對高糖脂培養(yǎng)胰島細胞增殖活力的影響

高糖脂培養(yǎng)2 d胰島細胞增殖與低糖培養(yǎng)組比較沒有顯著差異，而第5天高糖脂毒對胰島細胞活力的抑制作用明顯，第5天時，5和10 mg/L OA藥物干預組及陽性對照組細胞增殖作用顯著高于高糖脂組(P＜0.05)(表2)。

2.3 齊墩果酸對高糖脂培養(yǎng)胰島細胞凋亡的影響

原代胰島細胞正常低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，細胞凋亡率為3.9%，高糖脂聯(lián)合培養(yǎng)組細胞凋亡率為15.1%，10 mg/L齊墩果酸干預組胰島細胞凋亡率為7.4%，凋亡率顯著降低(圖1)。

3 討論

近年來糖尿病治療從關注胰島素外周靶器官轉(zhuǎn)變到更關注胰島本身，英國糖尿病聯(lián)盟［8］前瞻性研究顯示，糖尿病患者胰島素分泌功能隨病程進展進行性下降，直至耗竭，絕大多數(shù)患者不得不依靠外源性胰島素控制血糖，因此提出保護胰島細胞功能，抑制胰島細胞凋亡對延緩糖尿病進展有重要意義。

表2 OA對高糖脂培養(yǎng)胰島細胞活力的影響Table 2 Effect of OA on islet cell viability under glucolipotoxicity(x ± s，n=5)

圖1 低糖、高糖脂、高糖脂+OA分別培養(yǎng)6 d對原代培養(yǎng)胰島細胞凋亡的影響Fig 1 Apoptosis of primary cultured islet cell under low level glucose，high glucolipo，high glucolipo+OA culture respectively

高糖脂毒性能抑制胰島素胞吐環(huán)節(jié)，引起胰島素含量衰竭，胰島素前體分子增加，進行性DNA片斷增加以及暫時的β細胞增殖反應等，毒性機制涉及胰十二指腸同源盒因子-1(PDX-1)及肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源核A(MafA)結合活性的降低，基因表達的抑制等［9］。本研究顯示高糖脂培養(yǎng)初期對胰島細胞增殖活力影響不明顯，但對胰島素分泌抑制作用已經(jīng)顯著并且隨時間推移持續(xù)增強，甚至耗竭。天然多酚齊墩果酸有一定對抗糖脂毒性促胰島素分泌作用，小劑量(5 mg/L)OA促胰島素分泌作用強，但短暫，作用特點類似25 mg/L格列本脲，而稍大劑量OA(20 mg/L)作用平緩持久，原因有待進一步研究。

高糖脂毒性能抑制細胞增殖加速胰島細胞凋亡［10］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體DNA損傷等參與了凋亡過程［11-12］，本實驗發(fā)現(xiàn)OA具有一定有促進胰島細胞增殖，對抗糖脂毒誘導的胰島細胞凋亡作用，這可能是其保護胰島細胞的機制之一。有趣的是OA及格列本脲促細胞增殖與促胰島素分泌效果的顯現(xiàn)時間上呈不同步現(xiàn)象，推測胰島素分泌匱乏時可能會代償性的促進胰島細胞增殖，胰島素分泌及細胞增殖過程周期不同不是呈直線式而是有峰谷現(xiàn)象造成，OA抗凋亡作用的具體分子機制有待進一步研究。

本實驗前期研究顯示，石榴皮乙酸乙酯提取物有對抗高糖脂毒促進胰島素分泌的作用，而齊墩果酸、鞣花酸及沒食子酸等是該提取物主要成分，本實驗進一步表明齊墩果酸具有一定抗糖脂毒促胰島素分泌作用，但依賴于合適的濃度及作用時間，齊墩果酸抗凋亡的機制靶點及其與其他多酚類是否存在協(xié)同作用等都是進一步研究的方向。

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