β-細辛醚通過PKA/CREB信號通路對快速老化癡呆小鼠腦組織凋亡機制的影響

王 睿 費洪新 李曉明 王 偉 劉 韓 牛英才 劉向民周 濤

1.齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究所，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院基礎醫學院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種神經系統退行性疾病，老年人多發，喪失生活能力，主要是在大腦海馬區域出現淀粉樣物質，即淀粉樣β蛋白 （amyloid β protein，Aβ），Aβ可以使組織產生大量自由基，干擾鈣離子代謝，影響炎癥反應，從而引起腦神經元發生改變，神經元功能也會發生改變，引起AD發生[1-2]，癥狀上表現學習和記憶障礙是最早出現的，目前國內外尚無特效藥物進行治療。石菖蒲揮發油是對機體中樞神經系統有保護作用有效成分,其中β-細辛醚是石菖蒲揮發油的主要成分，β-細辛醚對機體自由基的產生有重要作用，是治療神經系統的一種藥物。β-細辛醚可促進氧自由基代謝，影響大腦學習和記憶能力。本文筆者通過將飼養動物分組后給予β-細辛醚探討AD發病原因，且觀察對老年癡呆小鼠PKA/CREB信號通路的影響作用和快速老化小鼠學習記憶能力影響，分析β-細辛醚藥物作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 β-細辛醚購于武漢博士德生物工程有限公司，制成0.1 mg/mL混濁液，每天小鼠灌胃量是2 mL；PKA、CREB一抗、SP試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；DydatechMR4000 型酶標儀購自SantaCruz公司，MPIAS-500 病理圖像分析系統由中國醫學科學院藥物研究所提供，其他均為國產分析醇試劑。

1.1.2 動物分組 選取健康昆明小鼠10只和快速老化小鼠30只，均為10個月大小、雄性、體重20～25 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。健康昆明小鼠10只作為對照組，30只快速老化小鼠物隨機分為模型組（10只）、實驗組（10只）、治療組（10只）。對照組采用生理鹽水灌胃，2 mL/次；實驗組采用β-細辛醚混濁液灌胃，2 mL/次；治療組采用腦復康水溶液5 mg/mL灌胃，2 mL/次；模型組采用生理鹽水灌胃，2 mL/次。所有小鼠均每天灌胃1次，持續3周。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮定位航行實驗 實驗小鼠灌胃3周后進行行為學測試，連續5 d，實驗前1 d適應性訓練，平臺放在第一象限，其他3個象限將其放入水中，每天各測1次，在2 min內尚未找到平臺，則將其放平臺10 s；若120 s之內找到平臺，則其在平臺10 s，實驗進行5 d。利用上臺潛伏期代表實驗小鼠的空間學習能力，采用Morrismicrosoft基礎類應用程序紀錄逃避潛伏期和游泳距離，兩次潛伏期算術均值作為這一天成績進行統計學分析，處理結果。

1.2.2 Morris水迷宮空間探索實驗 實驗小鼠進行空間探索試驗是任選一個入水點將小鼠放入水池中進行試驗，記錄各組實驗小鼠在規定的時間內游泳軌跡，考察各組實驗小鼠對原平臺記憶，選擇任選一相同入水點將各組實驗小鼠放入水池中，記錄各組實驗小鼠在實驗進行2 min之內游泳路線，同時記錄停留時間，并對其進行實驗統計分析，處理結果。

1.2.3 PKA、CREB的測定 實驗小鼠乙醚麻醉，斷頭取出含有海馬組織的腦組織，福爾馬林固定24 h，PBS洗滌，4℃保存12 h，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，切片組織厚度6 μm，采用海馬組織分別測定PKA、CREB，37℃溫箱孵育10 min，PBS洗滌，抗原修復10 min，正常羊血清37℃溫箱孵育10 min，一抗 （PKA、CREB 為 1 100）37℃溫箱孵育 1 h，PBS 洗滌，二抗 IgG-HRP加入后，37℃溫箱孵育 30 min，PBS洗滌，DAB顯色液顯色，PBS洗滌，蘇木精染色，脫水，透明，封片，測定部位在海馬區，使用病理圖像分析系統測定吸光度值，計算陽性細胞數。

1.2.4 小鼠海馬神經元形態學光鏡觀察 實驗小鼠乙醚麻醉，斷頭處死，取出腦組織，沿冠狀切面切下前囟尾側2.2～4.3 mm的海馬組織，福爾馬林固定，PBS洗滌，4℃保存12 h，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，連續切片，切片厚7 μm，HE染色，光鏡下觀察拍照。

1.2.5 小鼠海馬神經元形態學電鏡觀察 實驗小鼠乙醚麻醉，打胸后心臟灌注固定液，快速取腦，分離海馬，2.5%戊二醛預固定2 h、四氧化鋨固定，梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，連續切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色，電鏡下觀察拍照。

1.3 統計學方法

用SPSS 12.0 統計軟件處理分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮定位航行實驗和空間探索實驗結果

Morris水迷宮實驗中，模型組與對照組比較，平臺潛伏期縮短，原平臺停留時間縮短，差異有統計學意義（P<0.05），說明模型穩定，可以用于實驗研究。實驗組、治療組與模型組比較，潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義（P<0.05），實驗組、治療組與模型組比較，原平臺停留時間延長，差異有統計學意義（P<0.05），提示β-細辛醚能改善快速老化小鼠的學習記憶能力、空間探索能力，增強小鼠的記憶力（表1）。

表1 各組小鼠Morris水迷宮實驗結果比較（±s，s）

表1 各組小鼠Morris水迷宮實驗結果比較（±s，s）

注：與模型組比較，①P ＜ 0.05，②P ＜ 0.05，aP ＜ 0.05，bP ＜ 0.05；治療組比較，③P ＜ 0.05，④P ＜ 0.05；與對照組比較，⑤P ＜ 0.05，⑥P ＜ 0.05

組別只數 平臺潛伏期 原平臺停留時間實驗組治療組模型組對照組10 10 10 10 23.52 ±0.13①③24.35 ±0.20a 34.61 ±0.11⑤51.18 ±0.05 39.71 ±0.21②④37.46 ±0.04b 20.16 ±0.16⑥55.36 ±0.14

2.2 小鼠海馬神經元PKA、CREB測定

小鼠海馬神經元模型組與對照組比較，PKA、CREB吸光度（A）數值明顯降低，蛋白數量較少，差異有統計學意義（P<0.05），表明模型組PKA表達減少，CREB信號表達減少。動物給藥后實驗組與模型組比較，PKA表達增多，CREB信號表達增多，差異有統計學意義（P<0.05），說明β-細辛醚對快速老化小鼠治療有效（表2）。

表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達分析（±s）

表2 各組小鼠PKA、CREB蛋白表達分析（±s）

注：與模型組比較，①P ＜ 0.05，②P ＜ 0.05；與治療組比較，③P ＜ 0.05，④P＜0.05；與對照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.05

組別只數 PKA(A) CREB(A)實驗組治療組模型組對照組10 10 10 10 70.12 ±0.42①③65.74 ±0.21 50.31 ±0.23a 96.17 ±0.54 85.24 ±0.38②④80.17 ±0.14 65.13 ±0.24b 88.45 ±0.69

2.3 光學顯微鏡觀察小鼠海馬神經元

倒置相差顯微鏡下觀察，對照組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞清晰可見，細胞形狀錐體形，細胞核清晰，細胞器豐富，可見明顯的尼氏體，顯示蛋白石合成旺盛（圖1a）；模型組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞形態不規則，呈現多邊形，細胞核較小，核仁不清晰，細胞整體損傷嚴重，細胞質中細胞器較少（圖1b）；治療組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞形狀錐體形或、長梭形，細胞器部分可以看到（圖1c）；實驗組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞少量損傷，細胞邊界較清晰，細胞形態較完整（圖1d）。

2.4 電子顯微鏡觀察小鼠海馬神經元

對照組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞形狀是錐體形，細胞器豐富，可見大量的粗面內質網，神經原纖維豐富、排列規則有序（圖2a）。模型組則小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞損傷嚴重，細胞體積縮小，細胞核周邊結構混亂，脂滴較多，細胞器較少（圖2b）。治療組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞結構清晰，細胞器清晰可見，線粒體豐富，異物顆粒較少（圖2c）。實驗組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞損傷較少，細胞結構較完整，神經原纖維較豐富，突觸小泡較多（圖2d）。

3 討論

AD是一種臨床常見的老年性記憶障礙疾病，由多種原因造成，國內外對于AD病因并不很清楚，AD的產生與大腦海馬神經細胞淀粉樣蛋白沉積、膽堿能神經纖維損傷、老年斑沉積形成、神經膠質細胞增生、化學性突觸結構改變、突觸密度喪失、神經遞質和神經調質的生成減少等[3]有關。祖國傳統醫學認為AD的發生是脾腎虧虛，痰濕阻滯，痰濁淤血所致，治療上以調節脾腎虧虛為主，痰濁淤血為輔。

AD動物模型首推SAM-P/8 小鼠，該模型是日本京都大學竹田俊男教授開發的一種較理想的快速老化小鼠模型，SAM-P/8 小鼠模型壽命較短、老化較快、海馬神經元變性壞死、小鼠腦皮質萎縮等病理改變典型，老年性癡呆是小鼠的主要癥狀特征。本文應用β-細辛醚觀察對快速老化SAM-P/8 小鼠PKA、CREB蛋白表達影響，快速老化小鼠Morris水迷宮實驗表明，β-細辛醚可明顯改善SAM-P/8 小鼠學習和記憶能力，模型組與正常組比較，尋找平臺潛伏期長，差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組能縮短尋找平臺潛伏期，與模型組相比，差異有統計學意義 （P<0.05），說明β-細辛醚對SAM-P/8 小鼠學習和記憶能力有所改善。

β-細辛醚還可以影響細胞Ca2+的代謝，通過刺激大腦海馬神經元，細胞質內Ca2+濃度增加，導致第二信使cAMP濃度增加，激活蛋白質依賴的PKA磷酸化，磷酸化有活性的PKA能改善化學性突觸結構功能改變[4-6]?；罨腜KA可以磷酸化CREB轉錄因子的轉錄，調節蛋白質表達，使各種信息可以長期保存，就會記住事件的發生過程。動物給藥后實驗組與模型組比較，PKA表達增多，CREB信號表達增多，差異有統計學意義（P<0.05），說明β-細辛醚對快速老化小鼠治療有效果。β-細辛醚可增強PKA蛋白的表達量，來維持大腦海馬神經元PKA/CREB這種特殊的信號通路傳導。

光鏡下對照組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞清晰可見，細胞形狀錐體形，細胞核清晰，細胞器豐富，可見明顯的尼氏體，顯示蛋白石合成旺盛；模型組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞形態不規則，呈現多邊形，細胞核較小，核仁不清晰，細胞整體損傷嚴重，細胞質中細胞器較少；治療組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞形狀呈錐體形或長梭形，細胞器部分可以看到；實驗組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞少量損傷，細胞邊界較清晰，細胞形態較完整，這些顯示β-細辛醚可改善老年性癡呆癡呆模型中大腦海馬神經元的病理特點，增強海馬神經元的學習記憶能力，減弱老年性癡呆的癥狀。電鏡下模型組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞損傷嚴重，細胞體積縮小，細胞核周邊結構混亂，脂滴較多，細胞器較少。治療組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞結構清晰，細胞器清晰可見，線粒體豐富，異物顆粒較少。實驗組小鼠海馬神經元腦組織錐體細胞損傷較少，細胞結構較完整，神經原纖維較豐富，突觸小泡較多，電鏡照片顯示β-細辛醚能減輕癡呆小鼠大腦海馬神經元的損傷。

綜上所述，β-細辛醚對老年癡呆的PKA/CREB信號通路有明顯的改善作用，β-細辛醚能增強該信號通路的傳導，達到治療老年性癡呆的目的。

[1] Weiner MW，Aisen PS，Jack CR Jr，et al.The Alzheimer's disease neuroimaging initiative:progress report and future plans[J].Alzheimers Dement，2010，6（3）：202-211.

[2] Latha Devi，Hindupur K.Mitochondrial trafficking of APP and alpha synuclein：relevance to mitochondrial dysfunction in Alzheimer's and Parkinson's diseases[J].Biochim Biophys Acta，2010，1802（1）：11-19.

[3] Reddy PH.Amyloid beta,mitochondrial structural and functional dynamics in Alzheimer′s disease[J].Exp Neurol，2009，218（2）：286-292.

[4] Fang YQ，Shi C，Liu L，et al.Pharmacokinetics of beta-asarone in rabbit blood，hippocampus，cortex，brain stem，thalamus and cerebellum [J].Pharmazie，2012，67（2）：120-123.

[5] Liu L，Fang YQ，Xue ZF，et al.Beta-asarone attenuates ischemia-reperfusion-induced autophagy in rat brains via modulating JNK，p-JNK，Bcl-2 and Beclin 1[J].Eur J Pharmacol，2012，680（1-3）：34-40.

[6] Kumar R，Mohanakrishnan D，Sharma A，et al.Reinvestigation of structure-activity relationship of methoxylated chalcones as antimalarials：synthesis and evaluation of 2，4，5-trimethoxy substituted patterns as lead candidates derived from abundantly available natural β-asarone[J].Eur J Med Chem，2010，45（11）：5292-5301.