和解聚散方對單側輸尿管梗阻大鼠腎組織α－SMA表達的影響

崔瑾，王耀獻，孫衛衛，劉尚建，沈存，呂杰，王曉楠

(北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700)

腎間質纖維化是多種慢性腎臟病發展到終末期腎病的共同途徑。它以過量細胞外基質在腎間質積聚及腎間質成纖維細胞增生為特征。腎小管間質受損時，小管細胞轉分化為成纖維細胞，隨著病變的加重，繼而轉變表型為肌成纖維細胞，并以α－SMA表達為特征［1］。因此，α－SMA是衡量腎小管間質纖維化的重要指標。

和解聚散方是王耀獻教授根據多年臨床經驗總結得出，從已經完成的動物實驗和臨床觀察的結果證實，和解聚散方能夠改善腎功能，延緩終末期腎臟病進程［2－4］。基于以上理論及前期研究結果，本文擬重點探討和解聚散方抗腎纖維化的作用機制是否與抑制大鼠腎組織α－SMA的表達有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠120只(體質量180～220g，購自維通利華實驗動物公司)，適應性喂養1周，隨機分為4組:I組假手術組，II組模型組，III組洛丁新組，IV組和解聚散方組，各30只，供給清潔大鼠飼料，自由飲水、進食，每籠5只，保持籠內清潔。

1.2 試驗藥物 和解聚散方由黃芪、當歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，來源于東直門醫院中草藥藥房，由北京中醫藥大學中藥學院制成煎劑，濃縮后高溫消毒封裝備用，濃度為每毫升含生藥1g。洛丁新(鹽酸苯那普利)購自北京諾華制藥有限公司。

1.3 造模及給藥方法 采用右側輸尿管結扎手術制備UUO模型，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組以5%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后局部剃毛，常規消毒鋪孔巾，選擇背部正中線肋脊角旁開1cm切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，將右側輸尿管結扎，然后連續縫合皮膚。假手術組手術入路方式同模型組，進入腹腔后分離右輸尿管但不結扎輸尿管。造模術后24h開始分別灌胃，Ⅰ、Ⅱ組灌胃生理鹽水(3ml/只)，Ⅲ組灌胃洛丁新(1.0mg/kg/d)，IV 組灌胃和解聚散方(9.8g/kg/d)。每組10只大鼠分別于造模術后第7、14、21天處死，留取梗阻側腎組織備用。

1.4 試劑 α－SMA小鼠來源單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);DAB顯色試劑盒 (北京中杉金橋生物技術有限公司);兩步法免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 腎組織病理檢查 取梗阻側腎組織，以4%多聚甲醛固定后，脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成3μm厚度的石蠟切片，分別行HE染色及Masson染色，光鏡下觀察腎臟皮質區及皮髓交界區腎小管、腎間質的結構變化。

1.5.2 免疫組化檢測 使用兩步法免疫組化試劑盒，操作步驟按試劑盒說明進行，PBS代替一抗作為陰性對照，DAB顯色，蘇木素輕度復染，采用光學顯微鏡(400×)觀察皮質腎小管間質區α－SMA的表達，以光鏡下細胞漿出現棕黃色顆粒為陽性信號。半定量分析采用Image Pro plus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件。光鏡下在皮質區選取10個不重疊視野，盡量避開腎小球和血管，計算陽性表達面積占總面積的百分比。

1.6 統計學處理 所有數據均以均值±標準差表示。采用SPSS 13.0計算機軟件對所得數據進行分析，計量資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05視為有統計學差異。

2 結果

2.1 病理學改變 HE、Masson染色觀察可知，假手術組腎間質無纖維化;模型組出現腎間質炎細胞浸潤，間質水腫，且伴有不同程度的腎小管上皮細胞腫脹、空泡變性及腎小管灶狀萎縮，小管管腔閉塞和/或擴張，部分腎小管腔內有蛋白或細胞管型，間質纖維化;洛丁新組、和解聚散方組病理變化較模型組減輕。

2.2 免疫組織化學和半定量分析 假手術組中α－SMA只在腎組織血管壁上表達;模型組、洛丁新組、和解聚散方組除血管壁上有表達外，可見大量陽性表達出現在腎間質細胞胞漿中，同時部分小管上皮細胞胞漿內也出現陽性染色顆粒。半定量分析顯示，模型組、洛丁新組、和解聚散方組中α－SMA在術后7天、14天、21天表達均明顯高于假手術組(P＜0.05)，兩個治療組的表達水平明顯低于模型組(P＜0.05)，和解聚散方組14天與洛丁新組14天比較有顯著性差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎小管間質α－SMA表達的比較(±s)

表1 各組大鼠腎小管間質α－SMA表達的比較(±s)

注:與假手術比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05;與洛丁新組比較，△P＜0.05;與同組第7天比較，★P＜0.05;與同組第14天比較，▲P ＜0.05。

組別 時間(天) α－SMA陽性表達面積(%)0.039 7 ±0.024 85模型組 7 5.890 9 ±2.051 74*14 7.380 9 ±2.256 39*21 10.684 8 ±3.390 23＊★▲洛丁新組 7 2.419 7 ±0.731 51*#14 4.843 0 ±3.042 69＊★21 3.660 8 ±1.359 94*和解聚散方組 7 1.856 1 ±1.305 75*#14 1.940 8 ±0.882 11*#△21 2.204 4 ±0.317 02*#假手術

3 討論

UUO模型是目前公認的較為成熟的一種研究腎小管間質纖維化的實驗動物模型。輸尿管結扎后隨著病變進展，間質纖維化形成，最終導致整個腎臟彌漫性損害，在本實驗中亦得到證實。

α－SMA作為一種細胞骨架蛋白，廣泛分布于平滑肌、肌上皮細胞、周細胞和一些基底細胞中，正常腎臟中僅有血管平滑肌細胞強陽性表達α－SMA，其它細胞通常不表達α－SMA。在腎小管間質纖維化發生發展中肌成纖維細胞出現，并在ECM過度沉積，該細胞主要表達α－SMA，α－SMA是肌成纖維細胞激活的特異性標志物。

腎組織α－SMA表達增高，表明腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞、間質成纖維細胞這些腎臟固有細胞被激活和異常增殖，具有肌成纖維細胞特性，合成和分泌細胞外基質增多，參與腎臟的纖維化。即這些細胞發生了細胞表型轉化，由靜止表型轉化為增殖表型或分泌表型。

腎纖維化的中醫病機是“腎絡微型癥瘕”形成，消癥散結在腎纖維化的治療中具有重要意義。王耀獻教授創立和解聚散方，并以此加減治療慢性腎臟病，在臨床中取得了較好療效。和解聚散方由黃芪、當歸、海藻、牡蠣、穿山甲等藥物組成，方中以黃芪、當歸為君，補血活血，補氣扶正;穿山甲，海藻，牡蠣為臣，消癥散結，諸藥共奏和解聚散，扶正通絡之功。全方虛實并調，標本兼顧，為治療腎纖維化的有效方劑。現代藥理研究證實，黃芪能清除氧自由基，通過抑制TGF－β產生，減少ECM生成，調節細胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護腎功能［5－6］。黃芪當歸合劑可明顯抑制大鼠腎小球內和腎小管間質部位α－平滑肌肌動蛋白的表達，下調JNK信號通路活化，從而抑制腎小球MsC表型轉化［7－8］。

本實驗結果表明，和解聚散方能夠降低UUO大鼠腎組織中α－SMA的產生，減緩腎纖維化的發展。充分說明了和解聚散方具有良好的抗腎纖維化作用，抑制腎臟固有細胞表型轉化及α－SMA的表達是其抗腎纖維化的機制之一，也說明了本方是一種防治延緩慢性腎臟病進展的有效中成藥物，有必要進行深入研究和臨床推廣應用。

［1］ 付平，張翥，馮梅，等.苦參堿對腎小管間質CTGF和α－SMA影響的實驗研究［J］.四川醫學，2005，26(10):1074 －1076.

［2］ 王耀獻，劉尚健，孫魯英，等.腎炎防衰治療慢性腎小球腎炎60例臨床觀察［J］.中國中藥雜志，2005，30(7):555 －556.

［3］ 王耀獻，劉尚健，趙宗江，等.腎炎防衰液對單側輸尿管梗阻大鼠的治療作用［J］.中國中藥雜志，2005，30(10):796 －797.

［4］ 王耀獻，劉尚健，趙宗江，等.腎炎防衰液對單側輸尿管梗阻大鼠腎臟保護作用［J］.中醫藥學刊，2005，23(3):26 －28.

［5］ 張翥，方敬愛，葉任高.中藥的腎保護與腎毒性［J］.中國中西醫結合腎病雜志，2001，2(9):552 －553.

［6］ 王收寶，田林紅.黃芪治療糖尿病腎病分子機制研究進展［J］.中醫藥學報，2011，39(1):118 －121.

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