中藥復方抗癇靈對戊四氮致癇大鼠腦組織海馬凋亡相關因子C－fos蛋白表達的影響

王國才，楊見民，車琳琳，王小東

(1.黑龍江省衛生廳，黑龍江 哈爾濱 150090;2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

癲癇與中醫學中“癇病”概念是一致的。以突然意識喪失，發則仆倒，不省人事，兩目上視，口吐涎沫，四肢抽搐，或口中怪叫，移時蘇醒，一如常人為主要臨床表現的一種發作性疾病。又有“癇證”、“癲癇”、“羊癇風”之稱。現代醫學認為，癲癇的發病機制極為復雜，影響因素頗多，迄今為止尚未完全闡明。在正常情況下，C－fos mRNA蛋白在中樞神經中有低水平表達［1－2］。但在機體受到機械、化學、缺血性腦損傷后，C－fos mRNA和 fos蛋白的表達水平有很大的變化［1－4］，尤其是各種致癇刺激能使C－fos mRNA和fos蛋白的表達產生明顯的變化，但這種表達具有刺激特異性、細胞特異性和時程特異性［5］。在癲癇發作時C－fos則快速一過性高表達，海馬為主要部位之一。通過檢測C－fos mRNA蛋白已廣泛用于判別抗癲癇藥物或其他相關因素在抗癲癇治療中的作用機制和療效［6］。中醫學則對癇病的認識由來已久，早在戰國時代的醫家就對癇病有一定的認識，雖然未給癇病以明確的定義，但至少它已經認識到癇病是一種腦病，且與先天因素有關。認為癇病系指臟腑受傷，神機受累，元神失控所致。中醫歷代醫家對癇病的病因病機觀點不一，近年來多認為與痰、氣、風、火、瘀血等因，并與情志有關，是由于正氣不足，臟腑經絡的功能低下所致，即病性屬本虛標實，正氣虧虛為其本［7－8］。故以活血化痰開竅，熄風鎮驚安神為法組成中藥復方抗癇靈，觀察其對戊四氮致癇大鼠腦組織海馬凋亡調控因子C－fos等表達水平的影響，從分子生物學水平探討中藥復方抗癇靈治療癲癇的可能作用機制，為臨床應用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 受試藥物

1 )中藥組方:由穿山甲、龍骨、乳香、沒藥、珍珠、膽南星組成。各藥為末混合。藥材購于黑龍江中醫藥大學專家門診。

2 )西藥陽性對照藥:丙戊酸鈉緩釋片，由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產;批號:081017;規格:20mg。研磨后用生理鹽水配制成懸濁液，用時搖勻，冰箱保存備用。

3 )致癇藥物:戊四氮(pentylenetetrazoze，PTZ):購自美國Sigma公司，運用電子天平精確稱取PTZ粉末，用前1h溶于生理鹽水新鮮配制。

1.2 實驗動物

實驗動物由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供的健康的雄性Wistar大鼠共90只(SPF級，體質量為180～220g，在通風、濕度、溫度適宜的實驗室中常規飼養，自由攝食、飲水1周，其中80只用于造模，造模成功后用于下一步實驗，10只用于設立實驗空白對照組。

1.3 主要儀器及設備

X－22臺式低溫高速離心機(德國 LEICAVLTRACUT公司);TA1003電子精密天平(上海天平儀器廠);LKB－NOVA型超薄切片機(瑞士);OLIMPUS圖像拍攝系統(日本OLIMPUS公司);HPIAS－1000型醫學彩色全自動圖像分析儀(北京);－70℃低溫冰箱MDF330型(日本 SANYO公司);4℃冰箱(BCD－218A/B型，青島海爾股份有限公司);FBG－1型生物實驗屏蔽柜(成都儀器廠);RNA濃度測定儀(姜堰市康健醫療器具公司);電熱恒溫水浴箱(日本HITACHI公司);DU－640型蛋白質核酸分析儀(美國BECKMAN公司);DYY－SB電泳儀(北京醫療設備廠);PCR儀PTC－200型(日本MJ公司);紫外可見凝膠檢測成像系統(北方醫療設備廠);SW－CJ－ID型醫用超凈工作臺(長沙光大科學儀器有限公司);HANNAPH211型酸度計(上海第三分析儀器廠);ZDX－35型坐式電熱蒸汽壓力鍋(上海申安醫療器械廠);實驗室電熱鼓風干燥箱(南京實驗儀器廠);DK－SB型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司);YDS－10型液氮罐(成都金鳳液氮容器有限公司)。

1.4 主要試劑

免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司);多聚賴氨酸(北京中杉金橋生物技術有限公司);濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);逆轉錄試劑盒(美國Roche公司);Sybr熒光定量PCR試劑盒(Roche);TaqDNA聚合酶(大連寶生物有限公司);總RNA提取試劑盒(華舜);10×RNA Buffer(大連寶生物有限公司);瓊脂糖(Amresco公司);PCR引物(上海英駿生物技術公司)。

2 實驗方法

2.1 動物分組

實驗分設6組。其中由戊四氮所誘導的癲癇大鼠63只隨機分成5組，設癲癇模型組(13)、丙戊酸鈉治療組(12)也即西藥對照組、抗癇靈低劑量治療組(13)，抗癇靈中劑量治療組(13)，抗癇靈高劑量治療組(12)。另設正常對照組10只。

2.2 造模方法［9－10］

采用戊四氮(PTZ)腹腔注射(iP)法，每日上午9∶00～11∶30腹腔注射戊四氮(ipPTZ)，注射劑量按亞致痙量35.0mg/kg標準。

2.3 給藥方法

正常對照組和癲癇模型組灌服相應量生理鹽水，其它各組給予藥物灌胃治療。每日固定時段灌胃給藥1次，連續灌胃治療6周。實驗期間各組均以普通飼料飼養，并自由飲水。

灌服藥物的劑量按正常成人(70kg)與大鼠給藥劑量系數(0.018)折算。

臨床丙戊酸鈉用量一般為20～30mg/kg，取其25mg/kg的劑量，換算成大鼠灌胃劑量為15.75mg/kg。

中藥抗癇靈低劑量組為0.25g/kg(為正常用量的1/2);中藥抗癇靈中劑量組0.5g/kg(為正常用量);中藥抗癇靈高劑量組1g/kg(為正常用量的1倍)。

2.4 灌注及取材

在冰凍的蠟塊上操作，取腦，修塊，在大腦視交叉與視乳頭之間冠狀切取組織塊，斷面可見白色纖維狀物，即是海馬。用鈍的刀片剝離左右海馬。一部分放入EP管中迅速投入液氮供Real time PCR使用。另一部分置于4%多聚甲醛固定液中，石蠟包埋，供免疫組化使用。

3 觀測指標測定

3.1 免疫組化方法檢測大鼠腦組織中海馬C－fos蛋白的表達

免疫組化采用非生物素二步法免疫檢測試劑盒。此試劑盒具有簡單、快速、敏感等特點，因為系統中不再使用生物素，所以避免了由于內源性生物素所造成的背景染色。統計陽性目標面密度值，取其平均值。按試劑盒說明操作。

3.2 實時熒光定量PCR(Real time PCR)方法檢測大鼠海馬組織C－fos mRNA的相對表達

PCR技術是一種體外擴增DNA或RNA片段的方法，PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。

表1 引物序列及擴增子長度

圖1 各組大鼠海馬組織c－fos增產物凝膠電泳圖

3.3 統計學處理

應用SPSS 17.0統計軟件對數據進行統計分析。所有數據以均數±標準差(±s)表示，兩兩比較用q檢驗，同組前后比較用配對t檢驗。

4 實驗結果

4.1 免疫組化方法檢測各組大鼠腦組織C－fos的表達

用圖像分析方法。采用 CMIAS系列 Motic.Med6.0數碼醫學圖像分析系統測量陽性目標的面密度值。每張切片隨機選擇5個200倍視野，經顯微鏡攝像系統輸入計算機，選擇免疫組化分析模塊，對實驗結果進行分析，結果見表2。

表2 各組大鼠腦組織中海馬C－fos蛋白陽性目標面密度值比較(±s)

表2 各組大鼠腦組織中海馬C－fos蛋白陽性目標面密度值比較(±s)

注:與空白組比較，※P ＜0.01;與模型組比較，★P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，◆P ＞0.05。

組別 n 陽性目標面密度值空白組 10 0.016 253 ±0.007 551★模型組 10 0.071 570 ±0.018 459※西藥組 12 0.030 957 ±0.004 800▲中藥低劑量組 11 0.048 194 ±0.010 082◆中藥中劑量組 12 0.038 886 ±0.030 121▲中藥高劑量組 12 0.035 819 ±0.019 931▲

由表2所示，模型組大鼠海馬中C－fos mRNA表達顯著增加，與正常對照組比具有顯著性差異(P＜0.01);各治療組大鼠治療后海馬中C－fos mRNA表達，較模型組均顯著降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，但均未達到空白組的水平(P＜0.01)。從數值上看，西藥組治療效果優于中藥高、中、低劑量組，但各治療組之間相比差異無統計學意義(P＞0.05)。

4.2 TUNEL法檢測各組大鼠腦組織海馬的細胞凋亡與半定量分析 結果見表3。

表3 各組大鼠腦組織海馬凋亡細胞面密度值比較(±s)

表3 各組大鼠腦組織海馬凋亡細胞面密度值比較(±s)

注:與空白組比較，※P ＜0.01;與模型組比較，★P ＜0.01;與模型組比較，▲P ＜0.05;與模型組比較，◆P ＞0.05。

組別 n 凋亡細胞面密度值空白組 10 0.002 287 ±0.000 288★模型組 10 0.004 834 ±0.000 657※西藥組 12 0.002 308 ±0.000 407★中藥低劑量組 11 0.004 136 ±0.000 639◆中藥中劑量組 12 0.003 298 ±0.000 987▲中藥高劑量組 12 0.002 797 ±0.000 295★

由表3所示，模型組大鼠海馬區凋亡細胞面密度值顯著高于空白組(P＜0.01)，各治療組大鼠海馬凋亡細胞面密度值明顯高于空白組，低于模型組，各治療組之間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。中藥高劑量組和西藥組與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01);中藥中劑量組與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05);中藥低劑量組與模型組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

5 討論

本實驗通過戊四氮(PTZ)致癇大鼠模型，運用光鏡、免疫組化、TUNEL法、Real time PCR等技術，對比觀察了各組大鼠的腦組織海馬病理形態結構、海馬神經元細胞凋亡、海馬組織C－fos mRNA的相對表達等指標的變化，探討活血化痰開竅，熄風鎮驚安神法抗癇的可能作用機制。結果表明，中藥復方抗癇靈能有效減少癲癇的發作頻率，降低其發作程度。高、中劑量的中藥復方抗癇靈、西藥丙戊酸鈉均對癲癇大鼠有良好的治療作用，各組間無顯著性差異，皆能成功控制癲癇大鼠的癇性發作，對癲癇大鼠的腦電圖有改善作用。而低劑量組的抗癇靈未能成功控制癲癇大鼠的癲癇發作，可能與藥物劑量不足有關。中高劑量的中藥復方，西藥能顯著降低癲癇大鼠大腦海馬的C－fos表達，低劑量的中藥復方降低大腦海馬C－fos表達不明顯，中藥復方的抗癇作用機制可能與降低腦內C－fos表達水平有關。

［1］ 李震中，阮旭中.馬桑內酯致大鼠癲癇狀態后海馬神經細胞凋亡的觀察［J］.中華神經科雜志，1997，30(1):30.

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［5］ 李震中，阮旭中.bcl－2、bcl－XL和bax mRNA在癲癇后DNA損傷誘導海馬細胞凋亡中的作用［J］.腦與神經疾病雜志，1997，5(3):141.

［6］ 李芳，孫紅斌.C－fos在癲癇發病機制及抗癲癇藥物療效評價中的作用［J］.國際神經病學神經外科學雜志，2009，36(1):67－69.

［7］ 孫守華.癲癇病機證治探要［J］.甘肅中醫，1999，12(6):3 －5.

［8］ 劉星，王歡.癲癇發作期本虛標實病機探討［J］.中醫藥研究，1999，15(6):8.

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［10］ 王國才，車琳琳，楊見民，等.中藥抗癇復方對PTZ致癇大鼠海馬c－jun基因及其蛋白表達的影響［J］.中醫藥學報，2011，39(4):24－26.