酶解蠶豆蛋白制備多肽酒及其抗氧化性研究

楊希娟 黨 斌 劉玉皎 耿貴工

(青海省農(nóng)林科學(xué)院1，西寧 810016)

(青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室2，西寧 810016)

蠶豆，別名胡豆、南豆、羅漢豆，是一種蛋白質(zhì)含量豐富的豆科植物。蠶豆產(chǎn)量在全世界食用豆類中位居第6，在中國其播種面積和產(chǎn)量是除大豆和花生之外種植面積和產(chǎn)量最多的食用豆類作物［1］。蠶豆中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)達25% ～35%，蠶豆蛋白的氨基酸組成接近人體和動物所需要的理想比例，其中賴氨酸質(zhì)量分數(shù)比谷類高出3倍，所以蠶豆被譽為植物蛋白質(zhì)的新來源［2－4］。目前蠶豆在我國主要用作蔬菜和飼料，我國食品加工業(yè)主要利用蠶豆生產(chǎn)粉絲，而作為重要營養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)未被合理利用。

蛋白質(zhì)在酶解過程中可獲得許多功能性多肽，這些多肽具有抗高血壓、降膽固醇、抗氧化、改善元素吸收、礦物質(zhì)運輸、促進生長等功能，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛［5］。其中將多肽進行發(fā)酵加工制作多肽飲料及多肽酒是多肽重要的應(yīng)用途徑。目前已有關(guān)于乳清多肽酒［6］和豆乳酒［7］的研制開發(fā)。目前利用蠶豆蛋白為原料制備蠶豆多肽酒還未見報道。本試驗利用蛋白酶酶解蠶豆蛋白制備多肽酒，并對其抗氧化性進行研究，以期為蠶豆蛋白的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蠶豆原料:青海省農(nóng)林科學(xué)院;葡萄酒用高活性干酵母:安琪酵母股份有限公司;堿性蛋白酶:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，活性≥200 000 U/g，生化試劑;二苯代苦味酰基自由基(DPPH·):Sigma公司;偏重亞硫酸鉀(二氧化硫含量為50%)、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三氯乙酸、鄰苯三酚、水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純;蔗糖為市售食品級。

S－263凱氏定氮儀:瑞典FOSS公司;SP－1500型實驗型噴霧干燥機:上海順儀實驗有限公司;TGL－20M高速臺式冷凍離心機:湘儀離心機儀器有限公司;雷磁PHS－25型pH計:上海雷磁儀器廠;HHS－6S電子恒溫不銹鋼水浴鍋:上海光地儀器設(shè)備有限公司;AL204電子天平:梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;FW－80高速萬能粉碎機:北京德威特儀器有限公司;DHP－9272電熱恒溫培養(yǎng)箱:蘇州江東精密儀器有限公司;UV－1801紫外－可見分光光度計:北京北分瑞麗分析儀器(集團)公司。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 蠶豆蛋白的制備工藝流程［8］

蠶豆→脫皮→粉碎(過80目篩)→調(diào)至pH堿性→加熱攪拌1 h→4 000 r/min離心20 min→過濾→濾液調(diào)pH酸性并攪拌→4 000 r/min離心20 min→沉淀層水洗至中性→噴霧干燥

1.2.2 蠶豆多肽酒制備［9］

1.2.2.1 工藝流程

蠶豆蛋白→酶解→滅酶→離心→酶解液→調(diào)配→接種活化酵母→發(fā)酵→終止發(fā)酵→離心或抽濾→配制→過濾→裝瓶→滅菌→冷卻后封口保存

1.2.2.2 操作要點

酶解:將蠶豆蛋白加水配成32 g/L的溶液，然后調(diào)節(jié)至pH 9.0，加入10 000 U/g堿性蛋白酶，45℃進行酶解2 h，在酶解過程中，要保持酶解液溫度恒定，并用0.1 mol/L的氫氧化鈉維持pH不變。

滅酶、離心:酶解完成后加熱煮沸5 min滅酶，然后3 000 r/min離心15 min，得到酶解上清液。

調(diào)配:酶解液先加入100 mg/L SO2，再加入占酶解液體積22%的蔗糖，攪拌溶解，于37℃的水浴中預(yù)熱。

活化酵母:將安琪葡萄酒用活性干酵母加入蠶豆多肽液中，在35～40℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)0.5 h，按一定的接種量接種酵母。

發(fā)酵:將活化后的酵母接種到發(fā)酵液中發(fā)酵，在一定的發(fā)酵溫度發(fā)酵一定時間，至可溶性固形物不再下降停止發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后酒精度達到10左右。

滅菌:在70℃條件下滅菌15 min，冷卻至室溫后封口保存。

1.2.3 蠶豆蛋白酶解優(yōu)化試驗

以影響蠶豆蛋白水解度的底物濃度、溫度、酶用量及pH為4個試驗因子，以蠶豆蛋白的水解度(DH)為目標，進行中心組合試驗設(shè)計(表1)。通過Design Expert 8.0.5軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，用以確定蠶豆蛋白酶解的最佳工藝條件。

表1 中心組合設(shè)計因素與水平

1.2.4 蠶豆多肽酒發(fā)酵試驗

1.2.4.1 蠶豆多肽酒發(fā)酵的單因素試驗

分別考察加糖量、酵母用量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對蠶豆多肽酒酒精含量的影響，確定蠶豆多肽酒發(fā)酵的適宜條件。各因素的試驗范圍為加糖量:14%、16%、18%、20%、22%;酵母用量:0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%;發(fā)酵溫度:19、22、25、28、31 ℃;發(fā)酵時間:3、4、5、6、7、8、9 d。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4.2 蠶豆多肽酒發(fā)酵條件優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，以加糖量、酵母接種量、發(fā)酵溫度為因素，以酒精含量為指標，采用四因素三水平L9(34)的正交試驗(表2)進行優(yōu)化選擇，試驗重復(fù)3次，取平均值。

表2 蠶豆多肽酒發(fā)酵正交試驗設(shè)計

1.3 測定指標與方法

1.3.1 酒精度的測定

采用酒精計法［10］。

1.3.2 蠶豆蛋白基本營養(yǎng)成分測定

蛋白含量測定:凱氏定氮法GB 5009.5—1985;淀粉測定:菲林試劑滴定法GB 5006—1985;粗纖維測定:酸堿處理法GB 5009.10—1985;粗灰分測定:550℃灼燒法GB 5009.4—1985;水分測定:直接干燥法 GB 5009.3—1985。

1.3.3 水解度的測定［11］

水解度(DH)=N1/N2×100%

式中:N1為水解后生成的NH2基的量/g/100 mL;N2為樣品總氮含量/g/100 mL。

水解后生成的NH2基的量由氨基氮的測定法即雙指示劑甲醛滴定法測得，樣品總含氮量由微量凱氏定氮法測定。

1.3.4 DPPH·清除能力測定［12－13］

取一定濃度的樣品溶液4 mL加入1 mL用無水乙醇配制的DPPH·溶液，并使DPPH·終濃度為0.1 mmol/L。用力振搖混勻后置暗室中靜置30 min，于517 nm波長處測定吸光度。按下式計算DPPH·清除率。

DPPH·清除率=［1－(Ax－Ax0)/A0)］×100%

式中:Ax為加入樣品溶液和DPPH·后的吸光度;Ax0為樣品溶液本底的吸光度;A0為DPPH·和蒸餾水的吸光度。

1.3.5 氧自由基清除率測定［14－15］

采用鄰苯三酚自氧化法測定。取50 mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL，置于 25 ℃水浴中保溫20 min，分別加入1 mL樣品溶液和0.4 mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1 mL 8 mmol/L HCl終止反應(yīng)，于299 nm處測定吸光度(Ax)，空白對照組以相同體積蒸餾水代替樣品。每個試樣做3個平行樣，取平均值，按下式計算O2－·清除率:

O2－·清除率 =(A0－Ax)/A0×100%

式中:A0為空白對照液吸光度，Ax為樣品溶液吸光度。

1.3.6 羥自由基清除率測定［16－17］

在試管中加入0.5 mL 10 mmol/L水楊酸－乙醇溶液，0.5 mL 樣品溶液 0.5 mL 10 mmol/L FeSO4溶液，3.5 mL蒸餾水，最后加入5 mL 100 mmol/L H2O2啟動Fenton反應(yīng)，搖勻后于510 nm處測定吸光度A1;取0.5 mL的蒸餾水代替10 mmol/L FeSO4溶液所測得的吸光度為A2;取0.5 mL的蒸餾水代替酶解液所測得的吸光度為A3。羥自由基清除率表示為:

·OH 清除率=［1－(A1－A2)/A3］×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆蛋白基本組成成分分析

本試驗制備的蠶豆蛋白粉中蛋白質(zhì)含量為82.6%(表3)，此外還含有部分的淀粉和纖維物質(zhì)。在蛋白酶解過程中底物濃度以凈蛋白含量計算。

表3 蠶豆蛋白主要組成成分/%

2.2 蠶豆蛋白酶解試驗

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗

采用4因素中心組合試驗設(shè)計對蠶豆蛋白酶解的工藝進行優(yōu)化，試驗方案及結(jié)果見表4。以蠶豆蛋白的水解度Y為響應(yīng)面，底物濃度(X1)，酶解溫度(X2)，酶用量(X3)，pH(X4)為自變量，采用 Design expert 8.0.5軟件對表4中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的數(shù)學(xué)模型為(已剔除不顯著項):

回歸方程經(jīng)方差分析后進行顯著性及擬合度檢驗。由表5可知，回歸方程P=0.000 1＜0.01，達到極顯著水平，失擬項檢驗P=0.139 4＞0.01，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.988 1，S/N(信噪比)為 31.187 遠大于 4，表明該數(shù)學(xué)模型中4個因素對酶解蠶豆蛋白水解度的影響達98.81%，而其他因素的影響和誤差占1.19%，即只有1.19%的變異不能由該模型解釋，預(yù)測值和實測值有高度的相關(guān)性。該回歸方程可較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可利用該回歸方程確定最佳酶解工藝條件。

各個因素與蠶豆蛋白水解度的顯著性分析結(jié)果(表5)表明，底物濃度(X1)、酶解溫度(X2)、pH(X4)對水解度的影響達到極顯著水平，即底物濃度、酶解溫度和pH對水解度有極顯著的影響;4個因素的二次項均極顯著，表明4個因素對蠶豆蛋白水解度的影響不是簡單的線性關(guān)系，存在明顯的二次關(guān)系;底物濃度(X1)與加酶量(X3)，底物濃度(X1)與pH(X4)、酶解溫度(X2)與pH(X4)的交互項回歸系數(shù)極顯著，即表明它們之間存在明顯的交互作用。

表4 中心組合設(shè)計試驗結(jié)果

表5 回歸模型的方差分析表

2.2.2 蠶豆蛋白酶解的優(yōu)化工藝條件

在試驗結(jié)果分析及模型擬合的基礎(chǔ)上，利用Design expert 8.0.5軟件進一步優(yōu)化試驗參數(shù)，即為獲得最大水解度情況下，優(yōu)化得到堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的適宜工藝參數(shù)為 X1=0.12、X2= －0.61、X3=－0.089、X4=1.00，Y=19.741 1%。即當?shù)孜餄舛葹?2 U/g，水解溫度為43.17 ℃，酶用量為9 821.12 U/g，pH 9.50的條件下酶解2 h，蠶豆蛋白的水解度理論最大值為19.741 1%。在優(yōu)化的工藝參數(shù)條件下酶解蠶豆蛋白，實際測得蠶豆蛋白水解度為19.64%，與預(yù)測值基本符合。

2.3 蠶豆多肽酒發(fā)酵工藝條件

2.3.1 加糖量對發(fā)酵酒酒精含量的影響

圖1 加糖量對蠶豆多肽酒發(fā)酵酒酒精含量的影響

由圖1可知，隨著加糖量的增加，蠶豆多肽酒酒精含量不斷增加，但增加的趨勢趨于平緩。加糖量低，發(fā)酵不完全，酒精生成量較緩，發(fā)酵酒的最終酒精度低。隨著加糖量的增多，發(fā)酵酒精度升高。但當加糖量達到20%以上時，發(fā)酵的酒精含量基本不在增加，加糖量應(yīng)選擇20%～22%。

2.3.2 酵母接種量對發(fā)酵酒酒精含量的影響

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，蠶豆多肽酒的酒精含量先升高后降低。接種酵母量少，發(fā)酵不充分，產(chǎn)生酒精的速度緩慢且發(fā)酵酒的最終酒度低。隨著接種酵母量的加大，發(fā)酵速度加快，生成較多的酒精。但當酵母接種量達到0.2%以上時，發(fā)酵酒的酒精含量基本穩(wěn)定，說明接種量過大會導(dǎo)致酵母早衰，同時會出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，并會產(chǎn)生苦味和酵母臭味，從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)。綜合考慮產(chǎn)品的風(fēng)味、酒精度和經(jīng)濟性，活性干酵母接種量選擇0.2%。

圖2 酵母接種量對蠶豆多肽酒發(fā)酵酒酒精含量的影響

2.3.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵酒酒精含量的影響

圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵酒的酒精含量呈現(xiàn)先增加后升高的趨勢。發(fā)酵溫度較低時，酵母發(fā)酵速度較慢，發(fā)酵酒的酒度低。隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母生長速度加快，能較充分利用營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生酒精，使得發(fā)酵酒酒度較高。當發(fā)酵溫度達到28℃時，發(fā)酵溫度過高，酵母發(fā)酵速度過快，不利于發(fā)酵酒風(fēng)味的形成，口感較差，而且高溫發(fā)酵容易引起酵母早衰，發(fā)酵能力減弱，糖分不能得到充分利用，在發(fā)酵后期容易出現(xiàn)酸敗。因此要獲得較高酒精度的蠶豆多肽酒，就必須把發(fā)酵溫度控制在適當?shù)乃剑纫ＷC較高的發(fā)酵速度，又要獲得較高的酒精度。所以發(fā)酵溫度選擇25℃。

圖3 發(fā)酵溫度對蠶豆多肽酒發(fā)酵酒酒精含量的影響

2.3.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵酒酒精含量的影響

由圖4可知，蠶豆多肽酒的酒精含量隨著發(fā)酵時間的延長出現(xiàn)不斷增加的趨勢，發(fā)酵前6 d酒精含量增加顯著，發(fā)酵6 d以后，發(fā)酵酒酒精趨于穩(wěn)定，發(fā)酵接近終點，因此發(fā)酵時間選擇6 d。

圖4 發(fā)酵時間對蠶豆多肽酒發(fā)酵酒酒精含量的影響

2.3.5 蠶豆多肽酒發(fā)酵的正交試驗結(jié)果

由表6可知，各因素對多肽酒發(fā)酵酒精度的影響順序為C＞B＞A。即發(fā)酵溫度對蠶豆多肽酒酒精含量的影響最大，其次是酵母接種量，最后是加糖量。極差分析的最優(yōu)組合為A1B3C3。即加糖量20%、酵母添加量0.22%、發(fā)酵溫度28℃。在此條件下制得的蠶豆多肽酒的酒精含量為9.6%，呈棕黃色，口感醇正、鮮爽、無澀味、略有苦味，具有發(fā)酵酒的醇香。

表6 蠶豆多肽酒正交試驗結(jié)果與分析

2.4 蠶豆多肽酒發(fā)酵過程中抗氧化性變化

從圖5可以看出，隨著發(fā)酵的進行，蠶豆多肽酒的·OH清除率和DPPH·清除率均出現(xiàn)先降低后升高的趨勢。發(fā)酵3 d時·OH清除率和DPPH·清除率均達到最低點。當發(fā)酵至4 d時，·OH清除率和DPPH·清除率又隨發(fā)酵的進行而增加，當發(fā)酵至5 d以后·OH清除率和DPPH·清除率增加的趨勢變緩，基本趨于穩(wěn)定，比發(fā)酵前有所增加。這是由于酵母菌生長繁殖需要營養(yǎng)，因此在最初的發(fā)酵過程中酵母消耗了發(fā)酵液中的部分多肽，使其發(fā)酵酒的·OH清除率和DPPH·清除率有所降低，隨發(fā)酵時間的延長，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生蛋白酶進而酶解蛋白質(zhì)生成氨基酸和多肽，從而增加了發(fā)酵液中多肽含量，使發(fā)酵酒的·OH清除率和DPPH·清除率有所升高。

圖5 蠶豆多肽酒發(fā)酵過程中抗氧化性變化

在發(fā)酵前4 d，隨著發(fā)酵時間的延長，蠶豆多肽酒的O2－·清除率逐漸下降，當發(fā)酵至4 d以后，O2－·清除率下降的趨勢逐漸趨于平緩，發(fā)酵至7 d時O2－·清除率由發(fā)酵前的62.43%下降至45.98%。原因有待進一步研究。

3 結(jié)論

3.1 采用堿性蛋白酶酶解蠶豆蛋白的最佳工藝條件為:底物濃度32 U/g，水解溫度43.17℃，酶用量9 821.12 U/g，pH 9.50，在此條件下酶解2 h，蠶豆蛋白的水解度達到19.64%。

3.2 確定蠶豆多肽酒發(fā)酵的適宜條件為:加糖量20%、酵母添加量0.22%、發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間6 d，在此條件下制得的蠶豆多肽酒的酒精含量為9.6%，呈透明的棕黃色，口感醇正、鮮爽、略有苦味，具有發(fā)酵酒的醇香。

3.3 蠶豆多肽酒具有較強的抗氧化性。蠶豆多肽酒的·OH清除率和DPPH·清除率較發(fā)酵前有所提高，O2－·清除率比發(fā)酵前有所降低。

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