蓖麻籽脂質提取與甲酯化衍生優化及其脂肪酸組成分析

樓喬明 楊文鴿 徐大倫 金 淼 吳東曉 鄭賢孟

(寧波大學海洋學院，寧波 315211)

蓖麻(Ricinus communis L.)俗稱大麻子、老麻子、草麻等，是大戟科一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，屬特殊工業油料作物［1］。目前，我國蓖麻籽產量居世界第二，僅次于印度。在世界能源日益匱乏的今天，蓖麻作為能源作物具有重要的經濟、環境和社會意義，被稱為可再生的石油資源［2］。

蓖麻籽油是自然界中具有獨特性能的植物油，是蓖麻油酸唯一的工業來源，其除含有一般植物油脂肪酸分子中的烯鍵和酯基外，還含有一個羥基，賦予其獨特的性質和用途［3－4］。目前，蓖麻籽脂肪酸的研究多集中于脂肪酸分析，以及產地和品系間的脂肪酸比較;但有關蓖麻籽脂肪酸前處理過程的研究較少［5－6］。在脂肪酸的分析過程中，脂質提取和甲酯化衍生是其中最為關鍵的兩大步驟，直接影響脂肪酸的定性定量分析。因此本研究對蓖麻籽的脂質提取和甲酯化衍生方法進行優化，并通過氣相色譜質譜方法定性定量分析蓖麻籽的脂肪酸組成，旨為蓖麻籽脂質前處理和脂肪酸分析提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蓖麻籽:青島市綠島大藥房。

1.2 儀器和設備

6890N型氣相色譜儀、5973型質譜儀:美國Agilent公司;Laborota 4000 efficient旋轉蒸發器:德國海道爾夫公司;AB135－S型精密電子分析天平:瑞士梅特勒－托利多公司;Milli－Q Synthesis超純水系統:美國Millipore公司。

1.3 試劑

37種脂肪酸甲酯混標和蓖麻油酸甲酯標準品:美國Sigma公司;甲醇、氯仿、二氯甲烷、正己烷:均為分析純，天津市科密歐化學試劑公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 脂質提取

Folch 提取法［7］;Bligh － Dyer提取法［8］;二氯甲烷 － 甲醇(2∶1)提取法［9］;正己烷 － 異丙醇(3∶2)提取法［10］;甲基叔丁基醚提取法［11］;索氏抽提法［12］。

1.4.2 甲酯化衍生

BF3－甲醇衍生法［13］:取 10 mg脂質樣品，加入1 mL乙醚－正己烷混合液(2∶1)，振蕩使樣品完全溶解，加入1 mL 1 mol/L KOH－甲醇溶液，充分振蕩后于60℃水浴加熱30 min，冷卻后加入5 mL 14%的BF3－甲醇溶液，再次于60℃水浴加熱30 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

HCl－ 甲醇衍生法［14］:取 10 mg 脂質樣品，加入1 mL 2 mol/L HCl－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于60℃水浴甲酯化15 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

H2SO4－甲醇衍生法［15］:取 10 mg脂質樣品，加入1 mL 5%濃硫酸－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于70℃水浴甲酯化60 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

KOH－甲醇衍生法:取10 mg脂質樣品，加入1 mL 1 mol/L KOH－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于60℃水浴甲酯化30 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

酸堿結合衍生法:取10 mg脂質樣品，加入1 mL 1 mol/L KOH－甲醇溶液，充分振蕩溶解后于60℃水浴甲酯化15 min，冷卻后;加入1 mL 2 mol/L HCl－甲醇溶液再次于60℃水浴甲酯化15 min，冷卻后，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

室溫快速衍生法［16］:取10 mg脂質樣品，加入1 mL石油醚(30～60℃)與苯混合液(1∶1)，振蕩使樣品完全溶解，加入1 mL 1 mol/L的KOH－甲醇溶液，混勻后在室溫下振蕩2～5 min，加入1 mL飽和氧化鈉溶液，用正己烷多次萃取脂肪酸甲酯并定容至5 mL，供GC/MS分析。

1.4.3 色譜條件

HP－INNOWax石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，高純氦氣為載氣，采用恒壓模式，壓力 54 kPa，分流比10∶1。進樣口溫度230℃，檢測器溫度250℃，柱溫以3℃/min由140℃升到230℃，并在230℃下保持10 min，整個分析過程為40 min。

1.4.4 質譜條件

GC/MS接口溫度280℃，EI離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描周期2.84次/s，質量掃描范圍m/z 50～500 u。

1.5 統計分析

利用SPSS18.0軟件對數據進行統計分析，數據以平均值±標準差表示，采用單因子方差分析法(ANOVA，Tukey檢驗)進行顯著性檢驗，并采用Duncan＇s法進行單因子多重比較分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蓖麻籽脂質提取

通過7種方法對蓖麻籽的脂質進行提取，脂質提取結果列于表1。從表1可知不同方法的蓖麻籽脂質提取率介于43.64% ～58.73%，且不同方法的脂質提取率具有顯著差異。Folch法作為脂質提取的經典方法，其蓖麻籽的脂質提取率最高(58.73%);二氯甲烷－甲醇法次之(58.25%);而正己烷－異丙醇法和正己烷索氏抽提法的脂質提取率較低，分別為48.57%和43.64%，遠低于Folch法和二氯甲烷－甲醇法，具有顯著差異(P＜0.05);而同為索氏抽提法，乙醚作為抽提溶劑，其脂質提取率顯著高于正己烷(P＜0.05)。綜合比較7種提取方法發現有機溶劑對脂質的溶解性是影響蓖麻籽脂質提取率的重要因素;氯仿、二氯甲烷對蓖麻籽脂質的溶解性較強，致使Folch法、Bligh－Dyer法和二氯甲烷－甲醇法對蓖麻籽脂質有著較好的提取效果;而正己烷對蓖麻籽脂質的溶解性較差，致使正己烷－異丙醇法和正己烷索氏抽提法的脂質提取效果較弱［17－18］。二氯甲烷對蓖麻籽脂質具有良好的溶解性，脂質提取完全，提取效果與Folch法無顯著差異(P＞0.05)，可作為氯仿的有效替代溶劑，且其毒性遠低于氯仿，能有效降低試劑的人體危害和環境污染，因此二氯甲烷－甲醇法是提取蓖麻籽脂質的理想方法。

表1 不同方法的蓖麻籽脂質提取率(n=3)

2.2 蓖麻籽脂質甲酯化衍生

蓖麻籽脂質經二氯甲烷－甲醇法提取，采用不同甲酯化方法衍生，萃取定容后通過氣相色譜質譜法進行峰面積和有效峰面積率分析，結果列于表2。從表2可知在6種甲酯化衍生方法中，H2SO4－甲醇法獲得的峰面積最大(2.85×106)，酸堿結合法(2.83×106)和 HCl－甲醇法(2.78 ×106)次之，室溫快速衍生法所獲峰面積最小(2.17×106)，表明H2SO4－甲醇法甲酯化衍生較為充分完全;而室溫快速衍生法雖具有衍生時間短和反應條件溫和等優點，但其甲酯化衍生程度較低［19－21］。

根據李鳳娟等［5－6］研究，結合氣相色譜質譜分析共從蓖麻籽中鑒定出7種脂肪酸，并對這7種脂肪酸的有效峰面積和有效峰面積率進行統計分析，發現6種甲酯化衍生方法的有效峰面積率介于87.05% ～99.11%，且不同衍生方法存在顯著差異(P ＜0.05)［5－6］。室溫快速衍生法的有效峰面積率最高(99.11%)，KOH － 甲醇法(97.95%)和酸堿結合法(97.17%)次之，而H2SO4－甲醇法的有效峰面積最低，僅為87.05%。不同甲酯化衍生方法的有效峰面積率差異主要與衍生過程中脂肪酸不飽和雙鍵遷移、反式異構化以及蓖麻油酸羥基脫水等副反應有關，酸堿條件以及長時間加熱過程易使異構化等副反應發生，致使有效峰面積率降低［13，20－21］。

通過對6種甲酯化衍生方法比較可知:H2SO4－甲醇法對蓖麻籽脂質衍生較為完全，但易使蓖麻籽脂肪酸發生異構化等副反應，降低目標脂肪酸的有效峰面積率;室溫快速衍生法甲酯化條件溫和、反應時間短、副反應少以及目標脂肪酸的有效峰面積率高，但其甲酯化衍生程度較低。綜合比較發現酸堿結合衍生法對蓖麻籽脂質具有較好的甲酯化衍生效果以及較高的有效峰面積率，是一種理想的蓖麻籽脂質甲酯化衍生方法。

表2 不同衍生方法的蓖麻籽脂肪酸峰面積(n=3)

2.3 蓖麻籽脂肪酸組成分析

蓖麻籽脂肪酸通過標準品對照和數據庫檢索進行定性分析，并按峰面積歸一法進行定量，其總離子流色譜圖和分析鑒定結果分別見圖1和表3。從蓖麻籽脂質中共鑒定出7種脂肪酸，主要為蓖麻油酸(12－OH C18∶1n－9)、亞油酸(C18∶2n－6)、油酸(C18∶1n －9)，少量棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)以及極少量亞麻酸(C18∶3n－3)和二十碳烯酸(C20∶1n －9)。

6種衍生方法所測的蓖麻油酸質量分數變化范圍為76.43% ～86.50%，其中室溫快速衍生法所測的蓖麻油酸質量分數最高，高達86.50%;HCl－甲醇衍生法(85.00%)和酸堿結合衍生法(84.88%)次之;H2SO4－甲醇法所測最低，僅為76.43%，具有顯著差異(P＜0.05);亞油酸和油酸質量分數變化范圍分別為4.88% ～6.27%和2.70% ～4.18%。不同甲酯化衍生方法所測蓖麻籽脂肪酸含量的差異主要與衍生過程中不飽和脂肪酸的雙鍵遷移、反式異構化以及羥基脫水形成共軛雙鍵等副反應有著重要關系［20－22］;在 H2SO4、BF3以及長時間加熱過程易使脂肪酸發生異構化等副反應，致使蓖麻籽中的不飽和脂肪酸和蓖麻油酸的含量顯著降低，造成分析損失。室溫快速衍生法反應溫度低、時間短，致使甲酯化過程副反應少，所測蓖麻籽不飽和脂肪酸和蓖麻油酸相對含量高;但其衍生不完全，甲酯化程度較低。綜合比較分析酸堿結合衍生法甲酯化完全、副反應少，能很好地反映蓖麻籽脂肪酸的真實組成，可作為一種理想的蓖麻籽脂質甲酯化衍生方法。

圖1 蓖麻籽脂肪酸甲酯的GC/MS總離子流色譜圖

表3 不同甲酯化衍生方法的蓖麻籽脂肪酸組成(n=3)

3 結論

3.1 采用不同方法對蓖麻籽脂質進行提取，結果表明有機溶劑的溶解性對蓖麻籽脂質的提取效果有著顯著影響。二氯甲烷對蓖麻籽脂質具有較高的提取率，且其毒性遠低于氯仿，是蓖麻籽脂質提取的理想溶劑。

3.2 不同甲酯化方法對蓖麻籽脂質的衍生效果有顯著差異。綜合比較6種甲酯化衍生方法表明酸堿結合甲酯化衍生方法具有甲酯化完全、副反應少等優點，是蓖麻籽脂質甲酯化衍生的一種有效方法。

3.3 蓖麻籽脂肪酸以蓖麻酸(76.43%～86.50%)、亞油酸(4.88%～6.27%)和油酸(2.70%～4.18%)為主，并含有少量的棕櫚酸(1.00%～1.37%)、硬脂酸(0.90% ～1.27%)。不同甲酯化衍生方法對蓖麻籽脂肪酸組成分析有較大影響，同時綜合分析6種甲酯化衍生方法發現酸堿結合法能更好地反映蓖麻籽脂肪酸的真實組成。

［1］孫福來.特用工業油源作物蓖麻［J］.中國種業，2005(3):21－22

［2］田清震，鄭洪源，郭志強.單雌蓖麻的研究與應用［J］.中國油料作物學報，2001(9):69－71

［3］汪多仁.蓖麻籽與蓖麻油應用進展［J］.糧食與油脂，2000(2):12－14

［4］Ogunniyi D S.Castor oil:A vital industrial raw material［J］.Bioresource Technology，2006，97:1086－1091

［5］李鳳娟，王昌祿，王玉榮，等.9個雜交蓖麻品種蓖麻籽中不同脂肪酸含量分析［J］.中國油脂，2008，33(1):62－64

［6］李鳳娟，王昌祿，王玉榮，等.蓖麻油快速甲酯化方法及其脂肪酸含量分析［J］.中國糧油學報，2009，24(6):52－55

［7］Folch J，Lees M，Sloane－Stanley G H.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues［J］.Journal of Biological Chemistry，1957，226(1):497－509

［8］Bligh E G，Dyer W J.A rapid method of total lipid extraction and purification［J］.Canadian Journal of Biochemistry and Physiology，1959，37(8):911 －917

［9］韓菊，段文仲.二氯甲烷代替氯仿提取脂肪的可行性研究［J］.分析化學，1998，26(9):1164

［10］韓菊，魏福祥，云自厚.采用低毒溶劑提取脂質［J］.分析化學，2002，30(4):450－453

［11］Matyash V，Liebisch G，Kurzchalia T V，et al.Lipid extraction by methyl－tert－butyl ether for high－throughput lipidomics［J］.Journal of Lipid Research，2008，49(5):1137－1146

［12］馮慧，洪家敏.索氏抽提法測定大豆粉中脂肪含量方法改進研究［J］.中國食物與營養，2009(8):50－51

［13］彭密軍，彭勝，伍鋼，等.杜仲籽油中α－亞麻酸的甲酯化方法優化［J］.中國油脂，2009，34(1):76－79

［14］樓喬明，徐杰，王玉明，等.氣相色譜/質譜法分析孔石莼中的脂肪酸［J］.色譜，2010，28(7):668－672

［15］唐芳，李小元，吳衛國，等.山茶油脂肪酸甲酯化條件研究［J］.糧食與油脂，2010(8):36－39

［16］佘珠花.氣相色譜法中油脂脂肪酸衍生化方法及其選擇［J］.糧食加工，2004(6):64－66

［17］韓菊，羅敏，高文惠.食品中脂質提取方法研究進展［J］.河北工業科技，2000，17(1):38－41

［18］陸麗麗，陳舜勝.鯽魚卵中脂質提取方法的比較［J］.上海水產大學學報，2008，17(1):104－108

［19］韓菊，魏福祥，云自厚.采用低毒溶劑提取脂質［J］.分析化學，2002，30(4):450－453

［20］寇秀穎，于國萍.脂肪和脂肪酸甲酯化方法的研究［J］.食品研究與開發，2005，26(2):46－47

［21］徐愛仁，胡曉煒，馬衛成，等.羚羊角脂類成分的提取與甲酯化條件優化［J］.醫藥導報，2011，30(4):433－436

［22］袁高峰，陳小娥，李鐸.共軛亞麻酸甲酯化方法的比較和優化［J］.中國糧油學報，2011，26(10):70－75.