食用油中3－氯－1，2－丙二醇酯檢測方法的研究進展

張 蕊 謝 剛 張 艷 郝希成 王松雪

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

3－氯－1，2－丙二醇酯(3－MCPD酯)是3－氯丙醇與脂肪酸的酯化產物。1983年西班牙首次在鹽酸精煉苯胺污染的菜籽油中檢出3－MCPD酯［1］，但20余年未受到重視。隨著科技的發展和對食品安全的高度重視，近年來3－MCPD酯越來越引起科學家及政府的重視。已有研究表明，3－MCPD酯在胰脂酶作用下會釋放出3－MCPD［2］，而3－MCPD是公認食品污染物，具有潛在致癌性。有文獻報導，未加熱和精煉的油脂中，沒有或只有微量3－MCPD酯(＜0.05 mg/kg)，而幾乎所有精煉油中3－MCPD酯含量顯著(0.2～20 mg/kg)［3］。3 － MCPD 酯成為繼反式脂肪酸之后油脂精煉過程中引入的又一潛在危害因子。

3－MCPD酯測定方法的研究已成為當今食品安全檢測的一大熱點。各國專業組織，如，德國油脂學會(DGF)、歐盟聯合研究中心(JRC)等以及國內外科研機構都在進行3－MCPD酯檢測方法的研究，近兩年來有大量相關報導。油脂中3－MCPD酯測定方法分為間接測定法和直接測定法。本文詳細介紹國內外食用油中3－MCPD酯的各種檢測方法研究現狀，討論未來3－MCPD酯檢測技術的研究發展方向，為今后我國建立食用油中3－MCPD酯標準分析方法提供參考和依據。

1 間接測定法

目前油脂中3－MCPD酯測定主要采用間接法。理論上3－MCPD酯有3種化合物，分別為sn1－3－MCPD單酯、sn2－3－MCPD單酯和3－MCPD雙酯。間接法不直接測定各種3－MCPD酯(sn1－3－MCPD單酯、sn2－3－MCPD單酯和3－MCPD雙酯)的含量，而是通過酯交換將油脂中存在的各種3－MCPD酯轉化為游離態3－MCPD，測定3－MCDP的含量，即，以3－MCPD的含量表示3－MCPD酯的總量。通過間接法測得的3－MCPD含量，包括油脂中原有的游離

3－MCPD和由油脂中各種3－MCPD酯轉化的3－MCDP，但文獻報導在食用油中游離態3－MCPD幾乎可以忽略不計(＜20 μg/kg)［4］。

間接法測定3－MCPD酯總量的一般分析步驟(5步)為:(1)首先將食用油溶解于溶劑中，添加適量氘代同位素內標;(2)然后在催化劑作用下，油中存在的各種3－MCPD酯與甲醇發生酯交換反應，轉化為3－MCPD;(3)中和反應物，鹽析，提取純化3－MCPD;(4)然后釋放的3－MCPD在衍生劑作用下衍生化;(5)最后用GC－MS檢測3－MCPD的含量，見圖1。已見報導的文獻中，各分析步驟使用過的試劑見表1。

表1 間接法各分析步驟中已報導過使用的試劑

圖1 間接法一般分析步驟

根據酯交換使用催化劑種類不同，間接法主要分為堿催化(如:NaOH、NaOCH3)間接法和酸催化(如:H2SO4)間接法。下面分別介紹這兩種方法的研究現狀。

1.1 堿催化間接法

有關堿催化間接法測定3－MCPD酯總量的研究報導較多，主要原因是常規堿催化間接法中，酯交換反應時間短(幾分鐘)，省時。但若不嚴格控制關鍵操作點，可能產生額外或消除一部分3－MCPD，從而造成過高或過低評估3－MCPD酯總量，影響結果。

早期較成熟測定3－MCPD酯總量的堿催化間接法是由Weisshaar R［5］提出。100 mg油樣溶于500 μL溶劑，加入250 μL 3－MCPD－d5內標溶液。在0.5 mol/L甲醇鈉/甲醇溶液作用下，反應10 min后，加入3 mL異己烷、100 μL冰醋酸和3 mL NaCl溶液(200 g/L)，棄去有機相，再加入3 mL異己烷，棄去有機相。向剩下水相中加入250 μL苯硼酸衍生化試劑，于80℃反應20 min。冷卻至室溫后，加入3 mL己烷提取3－MCPD衍生物，最后用GC－MS檢測3－MCPD的含量。

隨著深入研究，Weisshaar R等［6］發現使用文獻［5］中報導的堿催化測定油脂中3－MCPD酯總量的方法存在缺陷，會過高估計3－MCPD酯總量。這一結論在2009—2010年歐盟委員會聯合研究中心(JRC)下屬的標準物質與測量研究所(IRMM)組織的測定食用油脂中3－MCPD酯試驗驗證中得到證明［7］。報告中測得3－MCPD酯含量過高的試驗多是采用文獻［5］中的堿催化方法。分析原因是，鹽析試劑是氯化鈉，其中的氯離子與油脂中存在的一些前驅物(如:縮水甘油)反應生成了額外的 3－MCPD，從而引起結果偏高。在 Weisshaar R等［6］這次研究中，提出了一種前處理方法，100 mg油脂溶解在0.5 mL 己烷/叔丁基甲基醚(80∶20)，加入0.5 mL 1－丙醇/硫酸(100:0.5)，45℃超聲波水浴中反應15 min。其中硫酸用于破壞油脂樣品中可能存在的縮水甘油及縮水甘油酯。油脂樣品經過前處理后按照堿催化方法測定，所測得3－MCPD含量作為樣品“真”3－MCPD酯總量。德國油脂科學協會(DGF)在此研究基礎上形成了官方方法C－III 18(09)［8］。

測定油脂中3－MCPD酯總量的官方方法C－III 18(09)備受關注，很多研究者對其進行了研究和改進。

Naoki Kaze1等［9］在 DGF標準方法 C－III 18(09)方法基礎上，研究了溶劑的極性對3－MCPD衍生物從水相到有機相中提取率的影響。與己烷相比，當使用丁醇、氯仿、乙酸乙酯提取時，回收率分別提高了(5.6 ±1.2)倍、(4.7 ±1.1)倍和(3.8 ±0.9)倍。其中丁醇極性強，但提取物中含雜質較多，影響MS檢測器，且丁醇沸點高，不易濃縮，因此從實用出發，選擇氯仿、乙酸乙酯較為合適。通過實際樣品測試，證明使用氯仿、乙酸乙酯代替己烷可提高DGF標準方法C－III 18的定量準確性。

Sjaak de Koning等［3］在DGF標準方法 C－III 18(09)方法基礎上，改進了GC－MS分析，將大體積進樣和GC×GC－TOFMS技術應用于3－MCPD酯的分析，提高了方法的靈敏度。鹽析時用NaCl溶液的提取率是使用純水提取效率的5倍，可提高分析的靈敏度，但Cl－存在，會產生額外的3－MCPD，影響測試結果;不使用NaCl溶液進行提取，可消除Cl－影響，但會損失靈敏度，大體積進樣的應用，解決了這一矛盾。大體積進樣25 μL代替標準方法的1 μL，不僅彌補因不使用NaCl溶液而損失的靈敏度，同時還進一步提高靈敏度。GC×GC的使用，可以消除基質干擾，使目標物質更好的分離，同時也增加柱容量，改進檢出限。此方法的檢出限為0.000 80 μg/g。TOFMS開放的離子源設計，連續100次分析，體系依然穩定。

王力清等［10］在DGF標準方法C－III 18(09)基礎上，將三重四極桿串聯質譜多重反應監測技術應用于3－MCPD酯總量的分析。通過優化質譜分析條件，3－MCPD酯最低檢出限為20 μg/kg，回收率在80.3%～105.4%之間，相對標準偏差3.45%。

Naoki Kaze1等［11］采用 NMR 技術，研究發現，使用DGF標準方法C－III 18(09)時，3－MCPD和縮水甘油會發生雙向轉化。在酯交換步驟，3－MCPD會部分轉化為縮水甘油(37%)，而在衍生化步驟中，有氯化鈉存在的酸性條件下，縮水甘油又部分轉化為3－MCPD(＞70%)，因此，C－Ⅲ18(09)并不適用于測定含有縮水甘油酯的油脂樣品中3－MCPD酯總量和縮水甘油酯的含量。研究還表明，使用方法C－Ⅲ18(09)中B部分并不能完全去除試樣中縮水甘油和縮水甘油酯。

目前DGF標準方法 C－Ⅲ 18(09)［8］因存在一定問題，已于2011年6月作廢，但同時兩個新的DGF 標準方法 C － VI 17(10)［12］和 C － VI 18(10)［13］已頒布。在2010年DGF聯合試驗中，一些數據表明使用DGF標準方法C－III 18(09)中B部分測定3－MCPD酯會過高。因此對C－III 18(09)進行了改進，形成了C－VI 17(10)，用于測定3－MCPD酯和縮水甘油酯的總和，不再用于3－MCPD酯總量的測定。C－VI 18(10)是Kuhlmann提出的方法，由兩部分組成。A部分，假設在室溫下沒有其他物質與無機氯離子反應生成3－MCPD，堿催化酯交換后經PBA衍生，然后測定縮水甘油酯、3－MCPD酯及可能的游離3－MCPD的總和。B部分，測定3－MCPD酯及可能存在的游離3－MCPD。然后通過A部分和B部分來計算縮水甘油酯。

此外，關于堿催化間接法，科研工作者還展開了其他方面的研究。

瑞士通用公證行(SGS)德國公司 Kuhlmann［14］研究指出，在強堿條件下釋放出來3－MCPD極易轉化為縮水甘油，從而影響3－MCPD的測試結果，因此Kuhlmann對堿催化條件進行了改進。改進后，酯化過程中釋放出的MCPD轉化為縮水甘油可以忽略。實驗中，加標樣品在緩和的堿催化條件下(即低濃度氫氧化鈉/甲醇)，于－25℃下反應至少16 h，釋放出MCPD和縮水甘油，接著加入600 μL溴化鈉酸性溶液終止反應，此時縮水甘油轉化成溴丙醇(MBPD)，然后加入苯硼酸(PBA)將生成的MCPD和MBPD衍生化，最后用GC－MS進行分析。Kuhlmann采用此方法參加了德國聯邦風險評估機構(BfR)組織的測定食用油脂中3－MCPD酯的能力驗證，五個食用油樣品的測試結果的 z值在－0.62～+0.35之間，較為理想。Kuhlmann還使用3－氯－1，2－棕櫚酸甘油酯(PP－3－MCPD)作為參比物，添加到空白芝麻油中，對方法進行驗證。添加濃度范圍在0.56～31 mg/kg的 PP－3－MCPD(相當于 0.1～5.7 mg/kg的3－MCPD)，標準曲線線性相關系數R2為0.999 6，檢出限(LOD)為 0.050 mg/kg ，定量限(LOQ)為 0.100 mg/kg。

Karel Hrncirik等［15］研究了在堿催化條件下，鹽析試劑(氯化鈉和硫酸銨)及內標(3－MCPD－d5和PP－3－MCPD－d5)對間接法測定3－MCPD酯總量的影響。研究表明，堿催化酯交換條件下，3－MCPD的穩定性差(只有40%左右的回收率)，易轉化為縮水甘油，影響方法的靈敏度。這與文獻［9］、文獻［11］提到的一致。發現使用硫酸銨時作為鹽析試劑，結果比較接近真值，而使用氯化鈉時，會過高評估油脂中3－MCPD酯的總量。這說明，在鹽析步驟時氯離子與油脂中存在的一些前驅物(如:縮水甘油)反應生成了額外的3－MCPD。他們還發現，使用硫酸銨作為鹽析試劑，測定結果不受鹽析步驟中pH的影響，當使用氯化鈉作為鹽析試劑時，鹽析步驟的pH對測定結果有很大的影響。當pH值大于3時，與硫酸銨相比，使用氯化鈉鹽析測得的3－MCPD的量高出近20%;當pH值小于3時，使用氯化鈉鹽析測得的3－MCPD的量高出近一倍。使用3－MCPD－d5作為內標，3－MCPD酯的測定結果會高出7%～15%，而使用PP－3－MCPD－d5作為內標，測定結果更加準確。分析原因是內標PP－3－MCPD－d5與食用油中存在的主要3－MCPD酯(主要為3－MCPD雙酯)結構更加相似。目前，在德國油脂學會(DGF)2011年頒布的用于分析油脂中3－MCPD酯的標準方法 C －VI 18(10)［13］已使用 PP －3－MCPD －d5作為內標。

1.2 酸催化間接法

已有文獻表明，酸催化間接法耐用性好，能提供更加可靠的3－MCPD酯總量的測量值，但常規酸催化酯交換反應往往需要16 h，比較耗時［15］。

Veronica Divinova等［16］以3 －MCPD －d5為內標，使用GC－MS檢測3－MCPD酯。含有3－MCPD－d5的樣品，加入1.8 mL H2SO4/甲醇，40℃下反應16 h。冷卻至室溫后，加入0.5 mL飽和NaHCO3溶液中和，55℃旋轉蒸發，殘留物溶解于2 mL 20%NaCl溶液中，衍生化，進 GC－MS進行分析。食用油樣品，3－MCPD檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別是1.1 mg/kg 和3.3 mg/kg。

Weisshaar R［5］將甲醇鈉/甲醇堿催化方法與Veronica Divinova等［16］提出的 H2SO4/甲醇酸催化方法進行了對比。使用兩種方法分別測定了10個樣品，包括甘油、單硬酯酰基甘油、兩個特級初榨橄欖油、精煉橄欖油以及這5個樣品對應加入1%NaCl的樣品。結果表明，添加了1%NaCl的樣品，使用H2SO4/甲醇酸催化，會產生大量額外3－MCPD，此結論與文獻［17］一致。在試驗中還發現未添加NaCl的樣品，使用H2SO4/甲醇酸催化比使用甲醇鈉/甲醇催化所測得的3－MCPD值偏高，此結果與其他研究酸催化間接法報導［15，17－19］不一致。Weisshaar R 給出的原因是可能樣品中或試劑中存在痕量的氯離子。

Alessia Ermacora等［17］評價了酸催化間接法測定3－MCPD酯的方法靈敏度和耐用性，研究了氯離子和縮水甘油對結果的干擾。結果表明，在酸催化條件下，縮水甘油酯不會干擾3－MCPD的分析結果。指出只有當氯離子添加量高出典型實際油品中氯離子含量(實際典型的油品中氯離子的含量一般少于10 mg/kg)一個數量級時，才表現出明顯的氯離子干擾。樣品分析之前通過使用去離子水萃取可消除氯離子的干擾。此外考察了酯交換時間(2～16 h)對3個樣品(精煉棕櫚油、加標棕櫚原油、煎炸油)測定結果的影響，結果表明4～16 h的測定結果一致，沒有顯著差別。將酯交換時間從16 h改為4 h，沒有降低結果的準確性和重復性。他們也指出使用PP－3－MCPD－d5測定結果更加準確，與文獻［15］一致。

R A Abd Razak等［18］基于德國聯邦風險評估機構(BfR)的方法 BfR －008［20］(酸催化)上，評估了酯交換時間對結果的影響，并評價了方法的回收率。他們考慮到棕櫚油熔點高，可能需要更長酯化時間，考察了16 h、18 h、20 h的測定結果，結果表明18 h和20 h的測定結果沒有差別，最終酯化時間選擇了18 h。添加量在0.25～6.0 mg/kg范圍內時，回收率在97.6%～107.9%之間。所測校準曲線線性相關性R2≥0.999，方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別是 0.25 mg/kg 和0.5 mg/kg。

Hrncirik等［15］研究結果表明，堿催化間接法易受酯交換時間和其他因素(如:pH)的影響，最終影響方法的回收率、特異性和耐用性，而酸催化間接法避免了這個問題。因為在酸催化間接法中，縮水甘油酯被不可逆轉的破壞(存在的縮水甘油酯在鹽析步驟中會轉化為額外的3－MCPD，從而干擾分析結果)。研究還表明在酸催化間接法中，鹽析試劑(硫酸銨、氯化鈉)的類型對測定結果沒有顯著影響。酸催化間接法表現出更好的耐用性。

Colin G等［19］對基于HFBI衍生劑的酸催化間接法進行了單實驗室驗證，研究了方法的準確性、重復性、方法檢出限、線性范圍以及耐用性。與Veronica Divinova等［16］的酸催化間接法有所不同，在酯交換前增加了前處理過程(加標油樣溶于正己烷/乙醚中，兩次加入5 mL去離子水，離心分離，棄去水層。有機層過無水硫酸鈉，旋轉除掉溶劑。最終溶于1 mL的THF，備用)，衍生化之前增加了Extrelut填料凈化步驟(因HFBI衍生劑對水分非常敏感，必須除去提取液中的水分)。酯交換過程與文獻［16］類似。結果表明，對于油脂，方法檢出限(LOD)為40 μg/kg，線性范圍為 40～10 000 μg/kg。當樣品中分別添加游離3－MCPD、氯離子、甘油、縮水甘油丁酸酯時，對3－MCPD酯的回收率沒有顯著影響，方法選擇性(耐用性)好。Colin G等［19］使用此方法參加了2009年歐盟聯合研究中心(EC JRC)組織的測定食用油脂中3－MCPD酯的能力驗證，2個食用油樣品測試z值分別為－0.1和+0.2之間，結果理想。

2 直接測定法

間接測定法只能測定油脂中3－MCPD酯的酯交換產物3－MCPD的總量，不能區分油脂中原有3－MCPD酯是單酯還是雙酯，這給3－MCPD酯安全性評估帶來問題。單酯和雙酯與腸道中胰脂酶的親和性不同［2］，在體內的酶解速率、代謝途徑和毒性都不同。因此，開發一種能同時分析游離3－MCPD、3－MCPD單酯和3－MCPD雙酯的檢測方法是非常必要的。直接法是指不將油樣中的3－MCPD酯裂解為3－MCPD，而直接分析各3－MCPD酯的含量。目前關于直接法測定3－MCPD酯的方法正式期刊上發表相對較少。

Zuzana Zelinková等［21］測定了嬰兒食品中油脂各3－MCPD酯的含量。在實驗室內合成了各種3－MCPD酯標準品。油脂溶于1 mL四氫呋喃，添加內標P－3－MCPD－d5和PP－3－MCPD－d5，上硅膠柱，用溶劑洗脫。收集250～500 mL含有3－MCPD雙酯流出液以及625～850 mL含有3－MCPD單酯流出液，用于GC－MS分析。方法可用于分析1，2－二月桂酸－3－MCPD 酯、1，2－ 二豆蔻酸 －3－MCPD 酯、1，2－ 二棕櫚酸－3－MCPD酯等9種3－MCPD酯。1，2－二棕櫚酸－3－MCPD酯最低檢出限為180 μg/kg，RSD為0.7%，在0.52～20.801 μg/mL 范圍內線性相關系數為0.999 5;棕櫚酸－3－MCPD單酯最低檢出限為200 μg/kg，RSD 為1.7%，在0.165～20.705 μg/mL 范圍內線性相關系數為0.996。

Haines等［22］采 用 LC － TOFMS 直 接 測 定3－MCPD酯，不需要衍生、強烈的化學處理過程。首先在實驗室內合成各種3－MCPD酯(如:3－氯－1，2－油酸甘油酯、3－氯 －1，2－亞油酸甘油酯、3－MCPD單酯混合物等)標準品，用于測定標準曲線。添加內標的樣品用HPLC的流動相B(100 mL 0.26 mmol醋酸鈉/800 mL亞甲基氯/100 mL乙腈)稀釋，進樣5 μL，HPLC 流速為0.25 mL/min。高分辨率的TOFMS可以消除干擾，提高分析的靈敏度。它的結果與DGF所測結果并不一致。他們認為是DGF中強烈的化學反應步驟－酯交換和樣品制備，產生了額外的3－MCPD，從而造成過高估計3－MCPD酯的總量。但Haines等［22］開發的方法，也面臨一些問題。試驗中為了得到有效ESI電離，檢測［M+Na+］加合物，向流動相中加入Na+。流動相中Na+會嚴重污染質譜系統，儀器需要每天使用前清理，一周需要一次昂貴清理。ESI源一些器件易被腐蝕，需要經常更換，如:不銹鋼的噴霧針需要一周更換一次(正常使用一年或更長時間更換一次)。這些都大大增加了儀器使用成本。

Eliska Moravcova等［23］開發了兩種直接分析各種3－MCPD酯的方法。一種是采用U－HPLC與高分辨率質譜orbitrap MS聯用技術分析植物油中9種3－MCPD雙酯。為消除油脂干擾，經過快速硅膠小柱從油脂樣品中分離出分析物，收集5～25 mL流出液用于分析3－MCPD雙酯。向油樣中添加2 mg/kg和10 mg/kg一系列的目標檢測物標物，回收率為89%～120%，RSD為5%～9%。方法最低檢出限為2～5 μg/kg(依據3－MCPD雙酯)。另一種是采用最新解析離子化技術－實時直接分析與高分辨率質譜orbitrap MS聯用技術(DART－MS)對樣品中3－MCPD雙酯半定量檢測，4 min中內可分析12個樣品，但最低檢出限高(40～118 μg/kg)。此外，因為3－MCPD單酯在ESI和DART條件下的離子化效率低，檢出限高(分別是365 ～420 μg/kg，2 996 ～4 300 μg/kg)，所以使用目前兩個方法檢測實際樣品中3－MCPD單酯不可能。

3 結語

無論是間接測定3－MCPD酯總量還是直接測定各3－MCPD酯含量都存在一定優缺點。

間接法最大優點是可操作性強［檢測儀器易得(GC－MS)、使用標準品品種少］，高靈敏度(因間接法是將所有的3－MCPD酯轉化為3－MCPD，最后測定總的3－MCPD)。校準曲線只需一個內標(如:3－MCPD－d5或PP－3－MCPD －d5等)和一個參比物(如:3－MCPD或PP－3－MCPD等)，在市場可以買到相應有效商業標準品，無需實驗室自行合成，提高了實驗室之間可比性。但另一方面間接法也存在缺點。間接法需要經過一系列前處理過程，往往在酯交換、鹽析等環節可能產生額外或消除一部分3－MCPD，從而造成過高或過低評估3－MCPD酯總量，影響測試結果。堿催化間接法易受酯交換時間和其他因素(如:pH)影響，在操作過程中要嚴格控制關鍵點;酸催化間接法耐用性更好，能提供更加可靠的3－MCPD酯總量測量值，但操作相對耗時。此外，間接法另一個缺點是無法區分3－MCPD、3－MCPD單酯和3－MCPD雙酯，只能以3－MCPD的含量來表示油脂中3－MCPD酯總量。

直接法最大優點是專一性強，可以區分3－MCPD、3－MCPD單酯和3－MCPD雙酯。直接法無需復雜的化學前處理，可簡單處理直接進樣，從而避免在酯交換、鹽析等過程中生成新物質，影響結果的準確。但直接法也存在缺點。首先，直接法需要系列3－MCPD酯參比物，而不同3－MCPD酯有效商業參比物非常有限。這些參比物不得不由實驗室自行合成，從而帶來一個問題，參比物的純度會影響分析結果的可靠性。其次，相對于LC－MS，單個3－MCPD酯的GC－MS檢出限較高。LC－MS法中使用的質譜檢測器多為高分辨率質譜檢測器，增加了分析成本，給實驗室日常應用帶來了困難。此外，Haines等［22］提出的LC－TOFMS法中，質譜系統污染問題需要解決;Eliska Moravcova等［23］提出ESI和DART法中需要解決3－MCPD單酯離子化效率低的問題。

由于間接法可操作性強，在一定時期內3－MCPD酯測定方法仍將主要采用間接法。目前間接法研究主要限于各個實驗室內的研究，缺乏系統嚴格評價。應系統對比各種間接法，研究現有間接法的可靠性，找出主要關鍵點，選擇適合方法進行協同驗證試驗，最后成為可靠的官方方法。直接法受有效商業參比物、儀器等限制，離實驗室日常應用還有一段距離。但直接測定3－MCPD、3－MCPD單酯和雙酯的含量，對于毒理學評價、形成機理研究有著重要的意義，因此直接法測定3－MCPD酯是未來發展趨勢。隨著將來有效參比物品種不斷增加、高端儀器的普及，直接法實驗室日常應用將成為可能。此外，在現有基礎上應進一步改進間接法和直接法，比較間接法和直接法的一致性。

對于我國來說，油脂科研人員應積極參與3－MCPD酯檢測方法研究，并在國外相對成熟3－MCPD酯檢測方法基礎上，建立一套適合我國國情、可推廣的3－MCPD酯標準檢測方法。

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