唐山地區食管癌患者癌組織中HPV16/18感染及p53基因多態性的檢測

李向利 宋會新 張術波

1.河北省遷西縣人民醫院胸外科，河北遷西 064300；2.華北煤炭醫學院附屬醫院，河北唐山 063000

食管癌是常見的十大惡性腫瘤之一，其發病率與地理區域、飲食習慣、遺傳因素、和病毒感染等有關。其發生、發展涉及多因素、多步驟相互作用的復雜過程，且與多種基因的表達改變緊密相連[1]。故通過了解相關基因如何表達和調控機制，為探查食管癌的病因及治療提供新的理論基礎。近年來具有高致病性的人乳頭狀瘤病（HPV）16/18與食管癌的相關性備受學者的關注。筆者收集唐山地區食管癌患者資料，探討HPV16/18感染和p53基因多態性與食管癌的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2005年5月～2010年11月在遷西縣人民醫院手術或胃鏡活檢共85例唐山地區食管疾病患者的新鮮食管組織標本，45例為食管癌患者，其中，男31例，女14例；年齡45～73歲，平均（56.7±5.8）歲；臨床分期按照國際食管癌會議制定的標準分期為Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例；有淋巴結轉移16例，無淋巴結轉移29例。另外20例良性腫瘤，20例正常食管組織。所有病例均經術前快速冷凍病理和術后常規病理檢查確診，術前均行未化療、放療及免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 HPV16/18的檢測 采用原位雜交試劑盒和生物素標記的高危HPV16/18 DNA探針，與蠟塊切片做DNA原位雜交。切片于60℃～70℃烘烤60 min脫蠟，置入雜交增強液里，高火加熱30 min，冷卻后用蒸餾水洗滌，滴加雜交液后蓋上蓋玻片，置原位PCR儀95℃變性5 min后，轉入含30%濕盒增效液的濕盒中，維持37℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡洗片，擦干后滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，37℃孵育30 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加動物非免疫血清，室溫孵育20 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加DAB顯色液，室溫孵育10 min，PBS浸泡洗片，擦干后蘇木素復染。常規封片，鏡檢。試驗陽性對照:已知HPV16/18陽性的食管癌切片。

1.2.2 基因多態性分析 采用PCR-RFLP方法檢測p53基因第4外顯子72密碼子多態性。先行引物設計，引物序列（5'→3'），正向引物 CAACACCATAGCAGTAGCAGC，反向引物CAGCCTCTCCTTCATACAGCC，按照試劑盒使用說明書對食管癌患者癌組織及其他標本提取DNA模板，而后行p53基因第四外顯子PCR擴增，利用限制性內切酶對PCR擴增產物酶切后用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統中觀察結果。

1.3 結果判斷

HPV16/18原位雜交陽性信號為棕黃色顆粒，主要定位在細胞核和細胞質內。對腫瘤細胞的觀察標準，陽性（+）:細胞核或質內見棕黃色顆粒，陰性（-）:細胞不著色。p53基因不同形態鑒定:僅在413 bp處顯示條帶的為Pro/Pro基因型，分別在253 bp和160 bp處出現條帶的為Arg/Arg基因型，而在413 bp、253 bp、160 bp均有條帶出現的為Pro/Arg基因型。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPVl6/18感染與食管癌患者不同部位組織中的表達情況

食管癌組織、良性腫瘤和正常組織中HPV16/18的感染情況45例食管癌組織中，HPV16/18陽性40例（88.9%），良性腫瘤中HPV16/18陽性2例（5.0%），正常組織中HPV陽性1例（2.5%），食管癌、良性腫瘤和正常組織中HPV16/18陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HPV16/18感染與食管癌患者不同部位組織中的表達情況

2.2 p53基因多態性在不同標本中的分布

食管癌、食管良性腫瘤和正常患者中三種基因型分布情況如下，在食管癌患者組織標本中各基因型分布頻率分別為Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占42.2%，Pro/Agr基因型占37.8%；食管良性腫瘤組織標本中各基因型分布頻率分別為Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占35%，Pro/Agr基因型占45%；在正常組織標本中各基因型分布頻率分別為Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占20%，Pro/Agr基因型占60%。見表2。

表2 p53基因多態性在不同組別標本中的分布

2.3 p53基因多態性與HPV16/18感染的關系

在食管癌患者癌組織中，HPV16/18檢測陽性者各基因型所占比例分別為純合子Pro/Pro基因型17.8%，Arg/Arg基因型42.2%，雜合子Pro/Arg基因型40.0%，HPV16檢測陰性者各基因型所占比例分別為Pro/Pro基因型37.5%，Arg/Arg基因型5.3%，Pro/Arg基因型5.6%；在患者癌組織中三種基因型構成比在HPV16/18感染組和未感染組差異經統計學分析有統計學意義（P<0.05）。而在食管良性腫瘤患者和正常對照組標本中，三種基因型構成比的差異均無統計學意義（P ＞ 0.05）。見表 3。

表3 p53基因多態性與HPV16/18感染的關系

3 討論

全世界每年食管癌發病人數大于30萬，其中一半在中國。其中環境因素、亞硝胺及營養因素為食管癌的主要病因因素，但其確切病因及發病機制仍未明了，因此展開了大量針對食管癌的分子生物學研究，其目的就是為了找出食管癌確切病因及發病機理，這為食管癌疾病臨床的早發現、早診斷和早治療起著決定性的作用[2]。近年研究發現HPV感染可能在食管上皮癌變中也起一定作用，并認為HPV感染下，可刺激或逐步引導并最終破壞原癌基因與抑癌基因之間相互依存、相互制約的平衡，致使細胞信號傳導和細胞周期紊亂，使突變細胞出現異常增殖。目前p53基因已成為研究比較透徹的一種抑癌基因，一致認為其與細胞周期調控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡等重要的生物學功能有關。該基因的缺損或突變常常被證實與腫瘤的發生有關，自1998年首次報道p53第72密碼子基因多態性與腫瘤的關系，有關p53多態性的研究越來越引起學者的興趣[3]。HPV是小分子DNA病毒，目前已有一百余種分型，分為高危型和低危型兩種，其中高危型主要是有惡變傾向，以HPV16/18為首，可導致p53喪失抑癌作用[4]。因此，發現早期診斷的特異性分子指標和手段已成為食管癌研究中的重要方向。

本研究顯示食管癌組織、良性腫瘤和正常組織中HPV16/18的感染情況45例食管癌組織中，HPV16/18陽性40例（88.9%），良性腫瘤中HPV16/18陽性2例（5.0%），正常組織中HPV陽性1例（2.5%），在食管癌組織中的HPV16/18陽性表達明顯高于良性腫瘤和正常食管組織，根據體外研究認為其編碼的E6蛋白能與p53蛋白結合形成復合物，使其失去抑癌作用，促使細胞的增殖，相關研究顯示HPV的感染存在地域性特征，并認為HPV的感染成為該地區食管癌高危因素，與本研究結果相一致[5]。HPV16/18高表達可促進正常細胞的惡變和食管癌細胞的增殖侵潤，考慮野生型p53蛋白半衰期短，具不穩定性，不易檢測，突變型P53蛋白其具有癌基因活性，可引起細胞惡性增殖且具有抗凋亡作用，導致細胞轉化和腫瘤的發生，使檢測成為可能，發生腫瘤時P53蛋白的大量表達均為突變型P53蛋白，其不再具有抑癌作用，而是促進細胞增殖。本研究顯示p53基因第72密碼子多態性在食管癌患者中Arg/Arg基因型占42.2%，明顯高于良性腫瘤和正常食管組織中的35%和20%。在p53基因多態性與食管癌關系方面研究認為Arg/Arg純合子基因型可能是食管癌的易感因素，與本文研究相同，但也有報道認為Por純合子攜帶者將增加患食管癌的風險[6-7]。對于p53基因多態性與HPV16/18感染的關系，本研究認為HPV感染和Arg/Arg基因型有共存性。而在食管良性腫瘤患者和正常食管組織中則未見相關性。有相關研究認為癌組織中p53該位點的基因類型存在突變的可能，各個基因類型頻率均不等，認為其與HPV16/18感染有關，與本實驗結果相同。其發生的原因可能是由于HPV16/18感染后，產生并分泌的特殊蛋白E6具有與P53結合并促進P53突變與降解，使P53原有功能的喪失，但其通過何種機制產生該效果仍有待于進一步研究[8]。

綜上所述，本文結果初步提示高危HPV感染與唐山的食管癌發生有關。聯合檢測食管癌中的HPV感染和Arg/Arg基因型的P53表達有助于評價食管癌的生物學行為。

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