黃蘭葉片和花瓣揮發(fā)性成分及其抑菌效果1)

蔣冬月

(北京林業(yè)大學，北京，100083)

李永紅

(深圳職業(yè)技術(shù)學院)

夏 兵 何 昉

(深圳市北林苑景觀及建筑規(guī)劃設(shè)計院)

潘會堂

(北京林業(yè)大學)

近年來，人們越來越重視植物景觀的生態(tài)、保健作用，具有揮發(fā)性氣味的芳香植物備受人們關(guān)注。植物揮發(fā)性芳香油中的某些成分不僅可以減少空氣中各種有害微生物的含量，還與人體身心健康有著密切的關(guān)系［1］。戚繼忠等［2］、謝慧玲等［3］、郭阿君等［4］、張風娟等［5］、李濤等［6］分別對不同的園林植物進行研究，指出園林植物對其生存環(huán)境中的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、放線菌、真菌等病原微生物具有不同程度的抑制和殺滅作用。

黃蘭(Michelia champak L.)是木蘭科含笑屬常綠喬木，其樹形婆娑美觀，香味比白蘭花更濃烈，為我國華南地區(qū)營造芳香園林植物景觀的優(yōu)良樹種［7－8］。黃蘭的花朵和葉片是提煉芳香油的原料，具有抗菌、抗感染、去風濕、潤喉和止痛的藥用功效［9－10］。目前國內(nèi)對黃蘭化學成分的研究報道主要集中在葉片和莖干的提取物［11－12］，尚未見到針對黃蘭花揮發(fā)性有機物抑菌效果的報道。為了科學地利用黃蘭營造芳香保健型植物景觀，文中采用固相微萃取的方法，對黃蘭葉片和花瓣的揮發(fā)性有機成分進行了提取，用氣象色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法進行芳香物質(zhì)成分分析，對比黃蘭葉片和花瓣揮發(fā)性成分的異同。同時采用水蒸氣蒸餾法提取葉片和花瓣的精油，研究了其對不同細菌生長的抑制作用。

1 材料與方法

試驗于2011年5—6月份黃蘭開花期進行，葉片和花瓣采自深圳職業(yè)技術(shù)學院西校區(qū)芳香植物園，選擇5 a株齡的黃蘭樹為供試植株。

黃蘭葉片和花瓣揮發(fā)性有機物成分與質(zhì)量分數(shù)測定:晴朗無風的08:00—10:00，在同一地點的黃蘭樹上分別摘取植株向陽側(cè)上、中、下部位的健康無損傷的葉片10片與盛開的花朵5朵，取其花瓣，分別剪碎，稱取0.5 g放置于5 mL萃取瓶中密封，靜置30 min，環(huán)境溫度為(22±3)℃。將型號為 DVBCAR－PDMS 100 μm 的 SPME 纖維頭(Agilent公司，美國)通過聚四氟乙烯瓶墊插入到萃取瓶中，置于樣品正上方0.5 cm左右，頂空萃取40 min，然后將纖維頭插入6890N/5975氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent公司，美國)的GC進樣口，解吸10 min。每次收集設(shè)置3次重復，同時吸附空萃取瓶中的氣體作為空白對照。

色譜條件:HP－5MS彈性石英毛細管色譜柱，長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，液膜厚0.25 μm，載氣為高純氦氣，不分流進樣，恒流流速 1.0 mL·min－1，進樣口溫度230℃，接口溫度280℃，柱溫初始溫度50℃，保持4 min，以每分鐘6℃的速度升至150℃，保持2 min，然后以每分鐘7℃的速度升至250℃，保持8 min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子阱溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500。

采集所得到的質(zhì)譜圖，利用NIST2008譜庫檢索，同時采用保留指數(shù)定性的方法來輔助質(zhì)譜檢索定性。根據(jù)所取得質(zhì)譜圖、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫與文獻［14－15］對照，再結(jié)合人工譜圖解析確認揮發(fā)物中各種化學成分。各成分在樣品氣體中的質(zhì)量分數(shù)采用峰面積歸一法進行計算，計算公式為:

質(zhì)量分數(shù)=(該物質(zhì)峰面積/樣品所有氣體峰面積之和)×100%。

通過該公式計算得出的結(jié)果代表某物質(zhì)在所采集的總氣體樣品中的質(zhì)量分數(shù)。

黃蘭葉片與花瓣揮發(fā)油提取:采集新鮮無病蟲害的黃蘭葉片和花瓣，去柄后用蒸餾水沖洗3次，分別平整鋪放在瓷盤中置于紫外燈下滅菌30 min，晾干備用。分別稱取100 g樣品置于型號為1788#的揮發(fā)油提取裝置(姜堰雪蓓公司，中國)，加入700 mL蒸餾水，根據(jù)《中國藥典》提取植物精油的方法［13］提取 3 h，收集揮發(fā)油，干燥。

供試菌液的制備:大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC6739、金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)ATCC6538、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC63501，由深圳職業(yè)技術(shù)學院化學學院微生物實驗室提供。所用初始菌種為2011年5月初活化，生長于試管斜面培養(yǎng)基。取一環(huán)斜面活化培養(yǎng)好的供試細菌，接種到50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于200 r·min－1的GYROMAX 747R型振蕩培養(yǎng)箱(Amerex Instruments公司，美國)，溫度為37℃，振蕩培養(yǎng)4 h，作為菌懸液母液備用［14］。

抗菌活性的測定:參照 Hiroyuki H et al.［15］的方法，稍作修改，方法如下:取5 mL的無菌離心管數(shù)個，每個加入3 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液30 μL，在不同的離心管中分別加入質(zhì)量分數(shù)為10%(V(精油)∶V(無水乙醇)=10∶90)、5%和2.5%(調(diào)配方法同上)的黃蘭葉片或花瓣揮發(fā)物油30 μL，同時設(shè)置空白對照，加入 30 μL 無水乙醇。經(jīng)振蕩均勻后，置于37℃、200 r·min－1的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。分別吸出200 μL，加入到96孔酶標板，用Varioskan Flash全波長多功能酶標儀(Thermo Scientific公司)檢測其在600 nm波長下的吸光光度值，按照下式計算抑菌率。每組試驗重復3次。

抑菌率=(對照組OD值－處理組OD值)/對照組OD值×100%。

數(shù)據(jù)采用MSD Productivity ChemStation進行分析，經(jīng)整理后輸入Excel表格和OriginPro 8.5進行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃蘭葉片與花瓣的揮發(fā)性物質(zhì)成分與質(zhì)量分數(shù)的差異

圖1、2分別為黃蘭葉片與花瓣的SPME/GC/MS總離子流圖。通過GC/MS分析，扣除本底空氣中的雜質(zhì)，在黃蘭葉片和花瓣中一共鑒定出33種揮發(fā)性有機物，其中萜烯類化合物24種、醇類化合物4種、酯類化合物2種，以及酮類、烷類和其他化合物各1種(表1)。

圖1 黃蘭葉片揮發(fā)性有機物總離子圖

圖2 黃蘭花瓣揮發(fā)性有機物總離子圖

黃蘭葉片與花瓣揮發(fā)性有機物成分與質(zhì)量分數(shù)不同。黃蘭葉片共檢測出10種揮發(fā)性成分，全部為萜烯類物質(zhì)。而黃蘭花瓣一共檢測出27種揮發(fā)性成分，其中種類最多的是萜烯類物質(zhì)(18種)，占花瓣總揮發(fā)物的52.87%，其次為醇類物質(zhì)4種，占30.72%，還含有少量的酯類、烷類、酮類及其他物質(zhì)(表2)。

表1 黃蘭葉片與花瓣釋放的揮發(fā)性有機物成分及質(zhì)量分數(shù)

表2 黃蘭葉片與花瓣揮發(fā)性有機物成分數(shù)量的差異 種

黃蘭葉片中檢測到的質(zhì)量分數(shù)最高的揮發(fā)性有機物是香葉烯，為40.57%，其次是石竹烯、β－欖香烯和甘香烯，其質(zhì)量分數(shù)依次為21.18%、12.86%、7.66%。黃蘭花瓣中檢測到的質(zhì)量分數(shù)最高的揮發(fā)性成分是芳樟醇，為26.63%，其次是香葉烯、β－欖香烯和安息香酸甲酯，質(zhì)量分數(shù)依次為22.19%、9.33%、8.21%。黃蘭葉片與花瓣中都檢測到的揮發(fā)性有機物一共有4種，分別為香葉烯、β－欖香烯、石竹烯和γ－欖香烯。

比較黃蘭葉片與花瓣揮發(fā)性成分的分析結(jié)果，雖然兩者都含有香葉烯、β－欖香烯、石竹烯，但葉片中的質(zhì)量分數(shù)要遠高于花瓣?；ò曛械膿]發(fā)性成分含有較多的芳樟醇、安息香酸甲酯、羅勒烯等物質(zhì)，而在葉片揮發(fā)物中并未檢測到這些成分。就黃蘭主要揮發(fā)物的藥用價值來說，香葉烯有祛痰、鎮(zhèn)咳的作用［16］，β－欖香烯有降血糖、防癌的功效［17］，石竹烯具有治療抑郁、焦慮的作用［18］，芳香醇具有催眠、鎮(zhèn)靜、抗抑郁的功效［19］。這幾種主要成分都具有良好的藥用價值，對人體健康具有藥用保健作用。在植物景觀設(shè)計中，可適當栽植黃蘭，營造有益于人體健康的生態(tài)保健型植物景觀。

2.2 黃蘭葉片與花瓣不同質(zhì)量分數(shù)的揮發(fā)油對3種供試菌種抑制作用的差異

經(jīng)水蒸氣蒸餾，從100 g黃蘭新鮮葉片中共提取精油0.5 mL，顏色為淡黃色;從50 g黃蘭花瓣中共得到精油0.3 mL，顏色為黃色，調(diào)制成不同質(zhì)量分數(shù)進行抑菌試驗。由表3可見，不同質(zhì)量分數(shù)的黃蘭葉片和花瓣精油對不同細菌的抑制效果不同。葉片精油的抑菌效果比花瓣精油的抑菌效果好。10%、5%和2.5%質(zhì)量分數(shù)的黃蘭葉片或花瓣的精油對大腸桿菌ATCC6739沒有抑菌作用。5%和2.5%的葉片精油對金黃色葡萄球菌ATCC6538有抑制作用，質(zhì)量分數(shù)為2.5%時抑菌效果最好，抑菌率達55.8%;只有質(zhì)量分數(shù)為2.5%的花瓣精油對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，抑菌率為36.81%。2.5%的葉片精油對枯草芽孢桿菌CMCC63501的抑制效果最佳，抑菌率達到68.20%;而同質(zhì)量分數(shù)的花瓣精油對枯草芽孢桿菌的抑菌率為50.89%。

表3 黃蘭葉片與花瓣不同質(zhì)量分數(shù)的精油對3種供試菌種的抑菌作用 %

大量研究表明，植物產(chǎn)生的自身保護性物質(zhì)——植物殺菌素能夠殺死細菌、真菌和某些多細胞生物［20－21］。本試驗結(jié)果顯示，一定質(zhì)量分數(shù)的黃蘭葉片精油和花瓣精油對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌效果。其原因可能是精油作用于細菌的細胞壁和膜系統(tǒng)，破壞其屏障作用，或通過破壞細胞內(nèi)的酶和功能蛋白，使其不能生長繁殖或缺失其繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)［22］。試驗還發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量分數(shù)的黃蘭葉片精油和花瓣精油對被試菌種的抑制作用與低質(zhì)量分數(shù)的精油相比有下降趨勢，甚至有促進被試菌種生長的趨勢，這與劉彬［23］、王占斌等［24］的研究結(jié)果相似，他們在研究中發(fā)現(xiàn)抑菌效果并不都是隨著精油質(zhì)量分數(shù)的增大而增強，有時低質(zhì)量分數(shù)精油的抑菌效果反而更為明顯。

3 結(jié)束語

黃蘭花瓣中檢測出的揮發(fā)性有機物的種類為28種，是葉片中的2.8倍。葉片中僅檢測到萜烯類物質(zhì)，其中香葉烯的質(zhì)量分數(shù)最高為40.57%;而花瓣中的揮發(fā)性有機物除了萜烯類，還有醇類、酯類、烷類和酮類等物質(zhì)，其中芳樟醇質(zhì)量分數(shù)最高，為26.63%。不同質(zhì)量分數(shù)的黃蘭葉片和花瓣精油對3種供試菌種的抑制作用存在差異。同質(zhì)量分數(shù)條件下，葉片精油的抑菌效果大多好于花瓣。但當花瓣精油質(zhì)量分數(shù)為5.0%時，對枯草芽孢桿菌的抑制作用顯著，而同質(zhì)量分數(shù)葉片的精油卻未檢測到抑菌效果。

植物釋放揮發(fā)性有機物的種類和數(shù)量不僅與植物的科屬、生理狀態(tài)、發(fā)育階段等自身條件有關(guān)，且與植物所處的環(huán)境條件密切相關(guān)。不同植物、同種植物不同發(fā)育階段和不同環(huán)境條件下?lián)]發(fā)性有機物的種類和質(zhì)量分數(shù)是否存在差異，有待進一步研究。黃蘭作為生態(tài)保健型植物在園林景觀中的配置密度和生態(tài)效益的評價等有待深化研究。

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