巴西蘑菇液體搖瓶培養基和培養條件的優化

聶建軍，李彩萍，楊玉畫，李兆斌

（1.山西省農業科學院農業資源與經濟研究所，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院農業環境與資源研究所，山西 太原 030006）

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murrill），又名姬松茸、柏氏蘑菇、小松菇，屬真菌門（Eumycota）、擔子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（A－garicales）、蘑菇科 （Agaricaceae）、蘑菇屬 （Agaricus）。

巴西蘑菇原產于巴西和秘魯，日本人首先引種栽培成功，將它取名為“姬松茸”。巴西蘑菇營養豐富，所含多糖、糖蛋白復合體、甾醇類物質具有提高機體免疫力、抗癌、抗病毒等功效，尤其多糖含量高于一般的食用菌，抗腫瘤活性遠高于靈芝，且口服效果不遜于注射，被日本醫學界稱為“地球上腫瘤患者最后的食品”。巴西蘑菇產品市場價格始終居高不下，是一種極具開發價值的珍貴食藥用菌。但是，巴西蘑菇的子實體培養很困難，產量非常有限，遠不能滿足市場的需求，所以采用液體深層培養的方法大規模生產巴西蘑菇菌絲體及其發酵液，開發出各種相關產品，具有很大的市場潛力[1-4]。本項研究對巴西蘑菇液體搖瓶培養基和培養條件進行了優化，旨在為把液體搖瓶培養的菌絲體作為中間過渡菌種而進一步擴大深層培養奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

巴西蘑菇（Agaricus blazei Murrill）MH1菌株，由山西省農科院食用菌研究所提供。

1.2 供試培養基

1.2.1 母種培養基

采用馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）培養基。

1.2.2 碳源基礎培養基

蛋白胨0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，pH值自然。

1.2.3 氮源基礎培養基

葡萄糖2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，pH值自然。

1.2.4 試驗培養基

將葡萄糖、蔗糖、玉米粉、乳糖、甘露醇和山梨糖分別加入碳源基礎培養基中（濃度均為2%），進行碳源優化試驗；將蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、尿素、豆餅粉和麩皮分別加入氮源基礎培養基中（濃度均為0.5%），進行氮源優化試驗。

1.2.5 優化培養基

根據1.2.4中碳、氮源單因素試驗結果，選擇較好的碳、氮源各2個，進行L9(34)正交試驗[5]。以葡萄糖（A）和玉米粉（B） 為復合碳源，酵母膏（C） 和豆餅粉（D）為復合氮源，采用4因素3水平正交試驗方法，篩選出巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養基。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與純化培養

將巴西蘑菇菌種從冰箱中取出后，25℃下恒溫放置7 d，使處于低溫中的菌種活化；無菌條件下把活化菌種接種于馬鈴薯瓊脂培養基平板上，28℃下恒溫培養3 d~4 d，之后挑取強壯菌絲體前端，接種于斜面培養基上，28℃下恒溫培養至斜面長滿，得一級菌種備用。

1.3.2 碳 (氮)源篩選試驗

取3塊0.5 cm2巴西蘑菇一級菌種，分別接種于不同碳（氮）源培養基中，500 mL三角瓶裝液體培養基100 mL，使氣生菌絲一面向上懸浮，25℃下靜置24 h；然后放入往復式搖床內，25℃，150 r·min-1條件下培養7 d。每種碳（氮）源試驗重復5次，結果取平均值。

1.3.3 培養基篩選

把巴西蘑菇一級菌種分別接入不同的正交試驗培養基中，培養條件同1.3.2，篩選出最佳培養基配方。試驗因素及其各水平如表1所示。

表1 培養基正交試驗的因素及水平

1.3.4 培養條件篩選

以篩選出的培養基為培養基。一級搖瓶500 mL三角瓶裝100 mL培養基，培養條件同1.3.2；在160 r·min-1的轉速下，二級搖瓶500 mL三角瓶的裝液量、接種量、培養溫度、培養天數按正交試驗處理。試驗因素及其各水平如表2所示。

表2 培養條件正交試驗的因素及水平

1.4 測定方法

1.4.1 菌球密度的測定

用吸管吸取1 mL培養液在玻璃板上攤成薄薄的1層，用接種針將菌球分開，進行直觀計數，如此重復5次，取其平均值。

1.4.2 菌球直徑的測定

隨機取菌球30個，排列成直線，并測其總長度，求得菌球的平均直徑。

1.4.3 生物量的測定

取培養好的菌絲體液在3 000 r·min-1的條件下離心10 min，蒸餾水洗滌，再離心，倒去上清液，菌絲體在60℃下烘干至恒重，稱量。

2 結果與分析

2.1 碳源篩選試驗結果

碳源篩選試驗結果見表3。

表3 不同碳源對巴西蘑菇菌絲體生長的影響

從表3可以看出，葡萄糖作為碳源，其平均菌絲體生物量最高，達12.28 g·L-1；平均菌球密度最大，約為223個·mL-1；平均菌球直徑較小，為1.68 mm。綜合比較，葡萄糖作為巴西蘑菇液體搖瓶培養基碳源效果最佳，其次是玉米粉、蔗糖等。

2.2 氮源篩選試驗結果

氮源篩選試驗結果見表4。

表4 不同氮源對巴西蘑菇菌絲體生長的影響

從表4可以看出，酵母膏作為氮源，其平均菌絲體生物量最高，達13.32 g·L－1；平均菌球密度較大，為228個·mL－1；平均菌球直徑較大，為1.81 mm。綜合比較，酵母膏作為巴西蘑菇液體搖瓶培養基氮源效果最佳，其次是豆餅粉、蛋白胨等。

2.3 正交試驗優化巴西蘑菇液體搖瓶培養基結果

L9(34)正交試驗結果與極差分析結果見表5。

表5 培養基配方正交試驗結果

從表5可以得出，影響巴西蘑菇菌絲體生物量的因素依次為A＞C＞D＞B，即葡萄糖＞酵母膏＞豆餅粉＞玉米粉；巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養基組合為A2B2C3D2，即葡萄糖2%、玉米粉2%、酵母膏0.75%、豆餅粉2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%。

2.4 正交試驗優化巴西蘑菇液體搖瓶培養條件結果

L9(34)正交試驗結果與極差分析見表6。

從表6可以得出，影響巴西蘑菇菌絲體生物量的因素依次為D＞C＞B＞A，即接種量＞裝液量＞培養天數＞培養溫度；巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養條件為A3B2C3D3，即培養溫度28℃，8 d，裝液量150 mL，接種量15%。

3 結論

通過篩選試驗發現，巴西蘑菇液體搖瓶培養基最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母膏。培養基中的玉米粉和豆餅粉來源廣泛、價格低廉、營養豐富，可以顯著降低生產成本，是大規模生產巴西蘑菇液體菌種的最佳原料。

表6 培養條件正交試驗結果

采用正交試驗方法篩選巴西蘑菇液體搖瓶培養基配方，結果表明，巴西蘑菇液體搖瓶最佳培養基為葡萄糖2%、玉米粉 2%、酵母膏0.75%、豆餅粉2%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%，最佳培養條件為裝液量每500 mL裝150 mL，接種量 15%，轉速 160 r·min－1，培養溫度 28℃，8 d。

搖瓶的裝液量和搖床的轉速決定了培養液溶氧量的大小。本試驗是在設定搖瓶轉速而改變裝液量的前提下優化出了最佳培養條件，但轉速是否最佳，對產生的巴西蘑菇菌絲體生物量是否有影響，有待進一步研究。

[1]隅谷立光，黃年來.巴西蘑菇[J].中國食用菌，2001，20(2)：6－7.

[2]陳智毅，李清兵.巴西蘑菇的食療價值[J].中國食用菌，2002，20(4)：4－6.

[3]Iwade T,Ito H.Miracle Himenmatsutake[M].Tokyo:Chikyu－sha,1982.

[4]張勝友.新法栽培巴西蘑菇[M].武漢：華中科技大學出版社，2010.

[5]杜榮騫.生物統計學[M].北京：高等教育出版社，2003.