3日齡大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織VEGF表達變化探討

劉利利

隨著圍產醫學的進步，早產兒腦損傷日益成為近年來國內外圍產醫學和新生兒學領域的研究熱點。研究報道，早產兒這種神經系統功能障礙主要由腦白質損傷所致[1]。最近研究表明，眾多細胞因子參與早產兒腦白質損傷的發病過程。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是近年來發現的一種細胞因子，其在早產兒腦白質損傷中的作用日益受到關注。本實驗建立3日齡大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，通過測定其后不同時間點腦白質區VEGF蛋白質的表達，探討其在3日齡未成熟大鼠缺氧缺血后的表達變化規律，進一步闡明VEGF在早產兒腦損傷發病機理中的作用，以期為早產兒腦損傷的防治開辟新的途徑，為臨床的進一步研究和應用提供客觀實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 92只3日 齡(出 生 日 為0天)SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不限，體重6.5～10.5 g。隨機分為缺氧缺血模型組(以下簡稱實驗組)50只和假手術組(以下簡稱對照組)42只，各組間雌雄、體重比較差異均無統計學意義(P>0.05)。術前稱重及編號，實驗組動物用無水乙醚吸入麻醉，仰臥位固定于手術臺上，碘伏消毒手術區，緊貼氣管右側做一約1 cm縱切口，切開皮膚及皮下組織，分離肌層，暴露右側頸總動脈，并用9-0絲線結扎，縫合傷口，再次消毒，表皮滴少量青霉素注射液。手術于5 min內完成。術后讓實驗鼠于37 ℃水浴箱中恢復2 h，后置于透明密封箱內，輸入含氧氣6%、氮氣94%的混合氣體，氣體流量1.5 L/min，測氧儀監測得箱內O2濃度為6%，4 h后取出，放回原飼養環境中繼續母乳喂養。對照組同樣分離頸總動脈，然后僅將手術線從右側頸總動脈穿過而不予以結扎，也不予以缺氧處理。整個手術及缺氧過程中，保持周圍環境溫度為30 ℃以上。實驗組有10只大鼠因不能耐受手術，分別在手術中和手術后死亡。對照組有2只不明原因死亡。兩組大鼠共80只(實驗組和對照組各40只)分別于缺氧缺血后12、24、48、72 h及7 d處死(每組各時間點8只)。

1.2 取材及切片制備

1.2.1 取材 大鼠乙醚吸入麻醉后，開胸暴露心臟，經左心室灌注肝素化0.9%生理鹽水20 ml，同時在右心耳處剪一切口，至流出液體變清為止。繼予以4%冰多聚甲醛30 ml灌注，至肝臟明顯變白及肺臟明顯水腫、四肢完全僵直后，美藍標記前囟位置，立即開顱取腦組織，將標本于4%冰多聚甲醛固定12 h，將固定的鼠腦從前囟后以視交叉為中心前后3 mm取材，再固定24 h。

1.2.2 切片制備 標本組織塊經梯度脫水、浸蠟、包埋。包埋后的組織蠟塊連續切片，厚度為3 μm，每塊組織取連續切片2張(1張HE染色，1張免疫組化)，分別裱于經APES處理的載玻片上，做免疫組化染色。

1.2.3 免疫組織化學染色法(SABC法)檢測腦組織內VEGF的表達。

1.3 陽性結果的判定及計數方法 (1)陽性細胞的判斷：VEGF顯色主要在胞漿，有明確棕色或棕黃色染色為陽性細胞；iNOS顯色定位于細胞漿/膜，有棕黃色染色為陽性細胞；(2)陽性細胞分級及計數方法：通過計算陽性細胞的比例和細胞染色強度，半定量評定VEGF及iNOS蛋白的表達。①根據陽性細胞所占的比例分為3個等級。1級：陽性細胞數<10%；2級：陽性細胞數10%～50%；3級：陽性細胞數>50%。②根據陽性細胞的染色強度分為5個等級。1級：陰性或微弱染色；2級：≤50%陽性細胞中等強度染色；3級：>50%陽性細胞中等強度染色；4級：≤50%陽性細胞高強度染色；5級：>50%陽性細胞高強度染色。

每組每個時間點各觀察8只大鼠，每只大鼠取相鄰切片2張，每張切片于右側腦室周圍白質和胼胝體區，各觀察3個不重疊的高倍視野(10×40)，取這3個視野細胞染色強度的等級平均值與陽性細胞比例等級數相乘，結果用任意單位(arbitraryunits，AU)值表示[2]。

1.4 統計學處理 采用SPSS 11.5進行統計學處理，計量資料以(±s)表示，表示成組設計的兩樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way-ANOVA)，兩兩比較，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Duttet′T3法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠腦組織均可見VEGF蛋白的少量表達，免疫陽性細胞呈棕黃色表達于細胞漿中，細胞核為淺藍色。VEGF在腦組織中呈廣泛表達，主要見于胼胝體區、腦室周圍白質的膠質細胞、海馬、皮質區的神經元、內皮細胞、軟腦膜細胞等。對照組胼胝體和腦室周圍白質VEGF的表達較弱，且隨日齡的增加表達沒有明顯變化，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組VEGF陽性細胞在腦室周圍白質和胼胝體區反應性增加，于缺氧缺血12 h表達開始增加，24 h表達達到高峰，7 d時恢復至正常，組間各時間點比較差異均有統計學意義(P<0.05)。實驗組胼胝體、腦室周圍白質VEGF的表達在12、24、48、72 h與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，7 d與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。HI對側亦有VEGF陽性細胞，但明顯少于缺血側。見表1、2。

表1 腦室周圍白質VEGF表達(AU值)(±s)

表1 腦室周圍白質VEGF表達(AU值)(±s)

注:實驗組各時間點間兩兩比較，P<0.05，F=36.88

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d對照組 (n=40) 2.71±0.79 2.88±0.99 2.63±0.95 2.63±0.92 2.83±0.82實驗組 (n=40) 5.67±0.80 12.0±2.14 9.0±2.14 7.29±1.16 3.13±1.04 t值 7.47 10.95 7.71 8.93 0.62 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 >0.05

表2 胼胝體區VEGF表達(AU值)(±s)

表2 胼胝體區VEGF表達(AU值)(±s)

注：驗組各時間點間兩兩比較，P<0.05，F=43.28

組別 12 h 24 h 48 h 72 h 7 d對照組 (n=40) 2.71±0.79 2.92±1.05 2.71±0.98 2.54±0.85 2.67±1.01實驗組 (n=40) 5.33±1.13 12.50±1.41 8.75±2.25 6.92±0.85 3.88±1.33 t值 5.40 15.39 6.96 10.27 1.55 P值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 >0.05

3 討論

隨著圍產保健及對宮內感染認識的重視，現臨床所見宮內感染造成的腦白質損傷病例已逐漸下降。因此，缺氧缺血成為早產兒腦白質損傷的主要原因。缺氧缺血后，機體所誘發的一系列病理生理過程是諸多因素共同作用的結果。近年來，各種細胞因子的研究受到關注并取得較大進展。其中VEGF作為一種腦保護因子，其作用亦顯重要。VEGF是Ferrara等[3]1989年首先從牛垂體的濾泡星狀細胞中純化出的同源二聚體糖蛋白。其分子量40～45 KD，耐酸、耐熱，等電點>7.5。人VEGF基因位于6號染色體Gp21.3，全長14 kb，包括8個外顯子、7個內含子，至少以6種亞型存在，分別為VEGF-A(VEGF165)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤生長因子(PIGF)。在正常成人和動物組織中水平很低，而在某些病理情況下，如缺血、缺氧時，VEGF表達明顯增加，尤以腦組織中VEGF表達升高明顯[4]。VEGF是內皮細胞的強力絲裂劑，具有強大促進新血管生成作用，是最具特異性且作用最強的內源性血管生成因子。VEGF需與存在于內皮細胞表面的特異性受體(Flt-1，Flk-1/KDR)結合，促進血管內皮細胞增殖，刺激體內新生血管生成。關于VEGF在未成熟大鼠缺氧缺血性腦白質損傷的表達變化，國內外少見報道。

在實驗中發現，各組大鼠腦組織均可見VEGF蛋白的少量表達，免疫陽性細胞呈棕黃色表達于細胞漿中，細胞核為淺藍色。VEGF在腦組織中呈廣泛表達，主要見于胼胝體區、腦室周圍白質的膠質細胞、海馬、皮質區的神經元、內皮細胞、軟腦膜細胞等。VEGF于缺氧缺血12 h表達開始增加，缺氧缺血24 h表達達到高峰，缺氧缺血72 h仍有表達，7 d時恢復至正常。該結果考慮與HI腦組織通過VEGF表達促進血液再灌注及供氧量的增加，促進腦白質少突膠質細胞生理功能的恢復有關。其表達呈現出先升高后下降的趨勢，這一結果與國外和國內一些研究一致。Ogunshola等[5]將新生大鼠出生后置于含90.5%氮氣及9.5%氧氣的缺氧條件下，發現VEGF蛋白在生后第8天表達明顯增加，并持續至生后33 d，說明缺氧可誘導VEGF蛋白的表達。國內秦元華等[6]研究VEGF在7日齡SD大鼠HIBD后腦組織中的表達變化得出，VEGF在模型后即刻即有表達，12 h達到高峰，隨后下降，7 d后呈低水平表達，說明大腦缺氧缺血會產生VEGF的高表達，且隨時間波動。其結果的差異可能與動物模型、動物日齡不同、缺氧時間及濃度不同等有關。

在實驗中還發現，實驗組大鼠VEGF的表達明顯高于對照組，且缺氧缺血側腦白質VEGF的表達明顯高于對側。這一發現也與國外及國內研究一致。國外Lennmyr等[7]發現，在腦缺血缺氧后，神經元、膠質細胞、內皮細胞VEGF的表達增強。國內于慕剛等[8]觀察7日齡大鼠HI后不同時間點VEGF和新生血管的表達，得出結論為，HI可誘導VEGF表達增加，VEGF參與了HI后腦組織新生血管的形成。

本實驗表明，3日齡大鼠腦缺氧缺血可誘導腦白質內源性VEGF的表達增強，這可能是機體對抗缺血所引起的腦白質損害的一種自身保護方式。但機體的這種反應尚不足以促進腦缺氧缺血后的神經功能康復，適時地激活內源性VEGF表達或應用外源性VEGF，充分發揮其神經保護、神經再生及血管再生的作用，可能為早產兒腦白質損傷的治療提供廣闊的前景。本結果為以后開展VEGF干預治療打下了實驗基礎。

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[3] Ferrara N，Henzel W J.Pituitary follicular cells secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commum，1989，161(2):851-858.

[4] Marti H H，Risau W.Systemic hypoxia changes the organ-specific distribution of vascular endothelial growth factor and its receptors[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(26):15809-15814.

[5] Ogunshola O O，Stewart W B，Mihalcik V，et al.Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain[J].Dev Brain Res，2000，119(1):139-153.

[6] 秦元華，徐立新，屈云霞，等.新生鼠缺氧缺血性腦損傷后血管內皮生長因子的變化[J].新生兒科雜志，2004，19(2):65-68.

[7] Lennmyr F，Ata K A，Funa K，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and its receptor(flt-1 and flk-1)following permnent and transient occlusion of the middle cerebral artery in the rats[J].Neuropathor Exp Neurol，1998，57(9):874-882.[8] 于慕剛，吳明哲，王華，等.新生大鼠缺氧缺血性腦損傷血管內皮生長因子表達與新生血管形成關系的研究[J].中國小兒急救醫學，2007，14(1):45-47.