重組腺病毒介導的血管生長素基因轉染對大鼠局灶性腦缺血的治療作用

唐春花 郭淮蓮， 唐文雄， 張偉赫

腦缺血后腦內血管生成情況與神經功能恢復有著密切的相關性。Krupinski等［1］研究發現腦梗死患者缺血腦區微血管密度顯著增加，梗死區域新生血管數目越多則患者存活時間越長。治療性血管生成的概念日益受到重視，通過重組腺病毒方式將促血管生成的基因轉染到腦組織從而刺激和誘導血管增生成為目前治療缺血性腦血管病的研究熱點，為治療缺血性腦血管病開辟了一條全新的思路［2］。血管生長素(angiogenin，ANG)是一種有效的促血管生長因子，具有很強的誘導新生血管生成和生長的作用［3］。研究已經證實，外源性給予ANG能刺激缺血區側支循環形成和增加局部血流，減少細胞凋亡，明顯改善動物肢體缺血［4］和心肌缺血［5］。ANG 對缺血腦組織的作用目前報道尚少。本研究利用大鼠腦缺血再灌注模型，采用側腦室內注射方式轉染Ad-ANG，探討ANG基因轉染對大鼠損傷腦組織的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠32只，體重280～330g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供。隨機分成重組血管生長素腺病毒治療組(Ad-ANG治療組，含綠色熒光蛋白基因)和重組綠色熒光蛋白腺病毒處理組(Ad-GFP對照組)，每組16只。兩組均在大腦中動脈阻塞再灌注術后24h經側腦室注射相應的重組腺病毒。

1.2 藥品、試劑及儀器 重組血管生長素腺病毒(Ad-ANG，含GFP基因)及重組綠色熒光蛋白腺病毒 Ad-GFP(Biosea)，2.5X1011pfu/ml。兔抗大鼠ANG多克隆抗體(Santa Cruz)，兔抗大鼠vWF多克隆抗體(Abcom)，二步法免疫組織化學試劑盒(北京中山金橋生物技術公司)，TUNEL試劑盒(R＆D)。儀器:Leica DM RXA顯微鏡(德國)。

1.3 大鼠線栓法腦缺血再灌注模型［6］及側腦室注射［7］大鼠10%水合氯醛(0.35g/kg)腹腔麻醉后取仰臥位，做頸部前正中切口，分離暴露左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈及翼腭動脈，用微動脈夾暫時夾閉頸總動脈，結扎翼腭動脈，并在頸外動脈近心端、遠心端分別穿線，遠心端系緊，近心端系一個松結(備用)，在頸外動脈的兩線間剪一個小口，將預先制備好的線栓，經小口插入頸外動脈并送入頸內動脈，插入深度(距頸總動脈分叉處)為(18.5±1.5)mm。外留1cm長尼龍線，縫合皮膚。栓塞90min后拔除尼龍線，此時血流再通，制成腦缺血再灌注模型。動物蘇醒后表現為提尾時右側前肢內收屈曲;同側 Horner征;爬行時向右劃圈;站立時右側傾倒。凡具有上述4項體征者列入研究對象。

缺血再灌注后24h行側腦室注射。將鼠固定于腦立體定位儀上，暴露顱骨，以顱骨面人字為體表標志，參照腦立體定位圖譜，取前囟后0.8mm、左旁開1.2mm，牙科鉆垂直鉆孔，用微量加樣器分別抽吸10μl的Ad-ANG或Ad-GFP垂直進針5mm，緩慢注入側腦室，注射時間10min，留針5min后緩慢拔出。

1.4 神經功能缺失評分 參照 Zea-Longa法［8］進行神經病學評分，即無神經損傷癥狀為0分，不能完全伸展對側前爪1分，行走時身體向偏癱側轉圈為2分，行走時向偏癱側傾倒或動物不能站立或動物打滾為3分，無自發活動、有意識障礙為4分。采用雙盲法于缺血再灌注時、側腦室注射時及注射后1d、3d、7d、14d 評分并記錄。

1.5 制備大鼠腦組織切片行熒光檢測及HE染色 大鼠腹腔麻醉后，經左心室插管灌注。在相應的時間點將每組大鼠快速灌流生理鹽水250ml(37℃)，再用4%多聚甲醛溶液300ml(4℃)灌流，維持20～30min，迅速取出腦。在大鼠腦切片器中沿視交叉冠狀位切取腦組織，將其置于4%多聚甲醛4℃過夜，換20%蔗糖浸泡至沉底，再換30%蔗糖，待腦組織沉底后 OCT包埋，冰凍切片，制成20μm厚的切片，每隔5張取連續5張貼片，每只大鼠取5張腦片于熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。另取一套腦切片行常規HE染色，脫水封片后于光鏡下觀察。

1.6 免疫組織化學染色檢測ANG陽性細胞切片入0.01mol/L PBS水化30min，3%過氧化氫10min，血清封閉1h(室溫)，滴加 ANG(1∶100)抗體50μl于各切片上，入4℃冰箱過夜。次日滴加二抗，室溫下孵育1h。各步驟間均入0.01mol/L PBS搖洗3次，DAB顯色，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并計數ANG陽性細胞。于室管膜周圍計數固定得2個高倍視野，缺血皮層下計數3個高倍(×40)視野，每組大鼠測量8張腦片，每張腦片選取固定得相同的5個位置點。

1.7 微血管密度檢測 采用兔抗大鼠vWF抗體(1∶800)及改良二步法試劑盒，進行免疫組織化學反應，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，封片觀察。微血管密度(MVD)計數按 Weidener等［9］方法進行，凡染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為一個血管計數，每張切片在同一皮層缺血區選擇5個高倍視野進行微血管計數，計算出每1mm2面積內微血管的數量，即微血管密度，然后求其均值。每組大鼠選取5個腦片進行統計分析。

1.8 凋亡細胞TUNEL染色 采用凋亡細胞DNA原位末端標記法(TUNEL)標記凋亡細胞。按神經細胞及組織原位凋亡檢測試劑盒操作步驟進行染色，顯微鏡下觀察凋亡陽性細胞的表達。選取缺血區額頂葉皮質上部3個高倍視野，內側尾狀核區2個高倍(×40)視野進行凋亡細胞計數。

2 結果

2.1 神經功能缺失評分 腦缺血再灌注大鼠側腦室注射重組腺病毒后3d及7d，與Ad-GFP對照組比較，Ad-ANG治療組大鼠神經功能缺失評分顯著降低(P＜0.05)，1d和14d時兩組間神經功能缺失評分無顯著差別(見圖1)。

2.2 綠色熒光蛋白的表達 Ad-ANG治療組和Ad-GFP對照組大鼠側腦室注射重組腺病毒后1d、3d時，熒光顯微鏡下可見室管膜周圍及脈絡叢有較強的綠色熒光，強度顯著高于7d和14d(P＜0.05)，7d后兩組大鼠上述部位熒光較前減弱，14d時兩組大鼠均僅見脈絡叢有微弱的綠色熒光，Ad-ANG治療組和Ad-GFP對照組在各時間點的熒光強度無顯著差異。

2.3 HE染色結果 各組大鼠缺血腦區均有不同程度神經細胞變性壞死，間質水腫，膠質細胞增生;部分呈點片狀，島狀梗死灶，范圍大小不等。與對照組相比，Ad-ANG治療組壞死區縮小，上述各種病理表現程度減輕。

2.4 ANG免疫組織化學染色結果 ANG陽性細胞呈棕黃色。Ad-ANG治療組大鼠鏡下可見室管膜周及缺血皮層及皮層下大量ANG陽性細胞，側腦室注射后3d、7d時陽性細胞數高于14d(P＜0.05)。Ad-GFP對照組也有少量ANG細胞的表達，主要分布于缺血區大腦皮質及皮質下，各時間點陽性細胞數明顯低于Ad-ANG治療組(見圖2)。

2.5 缺血腦區微血管密度分析 vWF免疫組織化學染色結果顯示，缺血腦區微血管形態不規則，管腔由染成棕黃色的內皮細胞圍成，部分血管無明顯管腔，內皮細胞呈條索狀，有的只見單個或成簇的內皮細胞。Ad-ANG治療組大鼠側腦室注射后3、7和14d時梗死周邊區可見較多散在的單個內皮細胞，微血管數量明顯多于Ad-GFP對照組(P＜0.01)(見圖3)。

2.6 TUNEL染色結果 TUNEL陽性細胞呈棕褐色，胞體縮小，可見核固縮和核破裂，主要分布在腦梗死灶及其周圍。在側腦室注射后3d、7d、14d，與Ad-GFP對照組相比，Ad-ANG治療組缺血腦組織凋亡神經細胞數目顯著減少(P＜0.05)(見圖4)。

圖1 Ad-ANG治療組和Ad-GFP對照組大鼠神經功能缺失評分在腦缺血再灌時、側腦室注射時及注射后隨時間變化趨勢圖，與Ad-ANG組相比較*P＜0.05

圖2 腦缺血再灌注大鼠側腦室內注射重組ANG腺病毒后腦內ANG陽性細胞計數情況，與Ad-GFP組比較#P＜0.01;與Ad-ANG治療1d組比較a P＜0.05;與Ad-ANG治療14d組比較b P＜0.05

圖3 腦缺血再灌注大鼠側腦室注射重組腺病毒后不同時間點缺血皮層微血管密度(血管數/mm2)

圖4 腦缺血再灌注大鼠側腦室注射重組腺病毒后不同時間點各組大鼠缺血腦區TUNEL陽性細胞計數

3 討論

腦缺血后梗死灶周圍血管通過新生血管供應缺血組織有助于缺血后神經功能恢復，補充外源性促血管生成因子有助于缺血腦區血管數目增加，減輕缺血性損害［10，11］。全身給予促血管生長因子的有益作用依賴于治療的時間點，腦缺血再灌注后1～3d給予促血管生長因子可促進神經功能恢復［10］。

血管生長素ANG是一種單鏈蛋白質，分子量為14.4kD，在血管生長過程中的多個環節均有作用［3］。在生理狀態下 ，ANG的表達受到嚴格的調控，缺氧及局部浸潤的巨噬細胞分泌TNF2α、IL-1β等因子能誘發ANG表達的增加，從而促進血管的生成［12］。我們既往研究［6］也發現大鼠腦缺血后再灌注腦內ANG的表達明顯增高，提示ANG可能參與腦缺血后腦組織的修復。外源性給予ANG能刺激缺血區側支循環形成和增加局部血流，并且已在外周動脈閉塞性模型［4］及慢性心肌缺血模型［5］中成功應用。

本實驗中大鼠于腦缺血再灌注24h后側腦室注射Ad-ANG，熒光顯微鏡下發現綠色熒光蛋白在室管膜周圍以及脈絡叢表達，注射3d后表達最為強烈，14d時脈絡叢仍有微弱表達，并有逐漸向缺血腦區遷移的趨勢，提示側腦室注射重組病毒可以在腦損傷大鼠腦內存活，轉染的Ad-ANG載體能夠在腦組織內表達，并能向缺血腦區移行。染色顯示Ad-ANG治療組缺血腦區間質的水腫和神經元的受損有明顯減輕，大鼠室管膜周圍及缺血皮層及皮層下可見大量ANG陽性細胞，在注射后3d、7d、14d時大鼠缺血區微血管的密度顯著高于Ad-GFP對照組，提示側腦室內注射Ad-ANG能在較長時間內上調腦缺血大鼠腦內ANG蛋白表達，促進新生血管的生成，在減輕腦缺血性損傷，對缺血再灌注損傷腦組織有保護作用。

細胞凋亡在腦缺血后腦神經損害中起著重要作用。抑制缺血后細胞凋亡是減輕腦缺血損傷的重要手段。本研究觀察到，在側腦室注射Ad-ANG后3d、7d、14d時腦梗死灶周圍組織凋亡細胞數顯著減少，提示ANG對腦缺血的保護作用可能還通過減少神經細胞缺血性凋亡而實現。

小結:本研究結果提示重組腺病毒介導的血管生長素基因轉染可以促進腦缺血大鼠缺血腦區新生血管的生成，減輕腦水腫，減少凋亡細胞數目等，從而促進神經功能的恢復。

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