PTZ誘導孕鼠癇性發作對胎鼠海馬中bax、bcl-2、capase-3 表達的影響

曲珍珍， 王維平， 毛卓鋒， 欒紹群， 謝 濤， 袁淑珍

癲癇是一種常見的神經系統疾病，可導致多種功能損傷，其中包括生理機能、精神心理、社會功能等。據估計0.5%的懷孕婦女患有癲癇，大多數癲癇婦女的子代發育正常，但仍有2% ～6%的孩子可能出現發育遲緩［1］，并且出現認知功能障礙的機率是正常母親所生孩子的2～7倍［2］。Adab N的研究顯示母親孕期全身強直陣攣發作，其孩子的IQ得分明顯降低［3］。細胞凋亡也稱細胞程序性死亡，伴隨著細胞的繁殖、分化在胚胎器官的正常發育中起重要作用。在正常胚胎器官形成時期，存在由bcl-2蛋白家族調節的細胞凋亡，促凋亡蛋白bax和抑凋亡蛋白bcl-2的比值決定了胚胎細胞凋亡的數目［4］。另外，caspase-3是凋亡效應蛋白之一，在胚胎組織的發育和病理性細胞死亡中有重要作用［5］。海馬在學習和記憶等認知功能中有重要作用，對于應激和其他有害的外源性刺激較其他腦區域更易受損傷。本實驗采用戊四氮誘導癲癇模型，觀察胎鼠海馬中bcl-2、bax及caspase-3的變化，以探討癇性發作對胎鼠影響的機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制備 雌性SD大鼠15只，河北醫科大學實驗動物中心提供，體重200±20g，SPF級。將大鼠隨機分為正常對照組(NC)10只、鹽水組(NS)10只、癲癇組(PTZ)15只。癲癇組每天腹腔注射1%PTZ(Sigma公司)35mg/kg;鹽水組給予等劑量的生理鹽水;對照組不做任何處理，注射完畢后各組大鼠每天觀察1h。按照Racine［6］分級標準連續3次獲得Ⅳ級或Ⅳ級以上的運動性驚厥大鼠為完全點燃。連續給藥30d，癲癇組隨機抽取點燃成功的大鼠10只，將3組雌性SD大鼠與雄性SD大鼠于晚8點合籠，次日早晨觀察陰栓，有陰栓者記為孕0d，各組孕鼠繼續孕前處理至孕20d。

1.2 Western blot檢測 bax、bcl-2 及 caspase-3蛋白水平 孕鼠懷孕第20天，將各組孕鼠腹腔麻醉后，剖腹取胎鼠，快速分離海馬，提取總蛋白，測蛋白濃度，取50μg蛋白95℃ ～98℃變性5min，以非連續Tris-SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉到硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉室溫封閉 1h，兔抗大鼠caspase-3多抗隆抗體(1∶400，巴傲德公司)、bax多抗隆抗體(1∶200，巴傲德公司)及bcl-2多抗隆抗體(1∶400，巴傲德公司)4℃過夜，漂洗5次，山羊抗兔IgG熒光抗體(1∶10000，Rocland公司)室溫避光1h，漂洗5次，遠紅外熒光掃描成像系統(Odyssey公司)掃描并測定目標蛋白單位光密度值，與GAPDH(1∶500，中杉金橋)比值后，做統計學分析。

2 結果

2.1 行為學結果 PTZ組大鼠腹腔注射6～8d后出現凝視、點頭、反復洗臉等動作，癥狀逐漸加重，最終出現全身強直陣攣發作。PTZ組大鼠懷孕后繼續給予35mg/kg的戊四氮，觀察到孕鼠癲癇發作程度減輕，癲癇抽搐持續時間縮短。

2.2 胎鼠海馬組織 caspase-3、bax及 bcl-2蛋白表達 與NS組和NC組比較，PTZ組胎鼠海馬組caspase-3、bax蛋白表達明顯增加，bcl-2蛋白表達明顯降低(P ＜0.05)(見表1)。

表1 caspases-3、bax及bcl-2蛋白在3組胎鼠海馬組織中的表達(±s)

表1 caspases-3、bax及bcl-2蛋白在3組胎鼠海馬組織中的表達(±s)

PTZ組與NC組及NS組比較*P＜0.05;NS組與NC組比較#P＞0.05

組別 例數caspase/gapdh bax/gapdh Bcl-2/gapdh PTZ NS NC 666 2.57 ±0.08*0.60 ±0.17#0.53 ±0.13 3.24 ±0.32*1.76 ±0.17#1.55 ±0.11 1.42 ±0.074*2.36 ±0.10#2.45 ±0.07

3 討論

本實驗采用戊四氮誘導大鼠慢性癲癇模型，觀察孕期母鼠的癇性發作對子代發育的影響，避免了臨床上因應用抗癲癇藥物而無法區分是癇性發作本身還是抗癲癇藥物對子代發育造成的不利影響。大量的實驗已證明，抗癲癇藥物能增加子代畸形的發生，而孕期癇性發作對子代發育有無影響的研究尚未見明確報道。本實驗采用腹腔注射生理鹽水作為假手術組，排除腹腔給藥針刺腹部對孕鼠造成的應激反應對胚胎的影響。

中樞神經系統存在正常的凋亡現象，貫穿于胚胎形成到衰老的整個過程中［7］。在細胞凋亡過程中，bcl-2家族和caspases家族起著重要作用，中樞神經系統局部缺血和感染導致的炎癥反應均與細胞凋亡有關。bcl-2家族大約由15個成員組成，根據其結構和功能的不同，可分為3個亞家族:(1)bcl-2亞家族，成員有bcl-2、bcl-xl、bcl-w 和 mcl-1等，主要抑制細胞凋亡的發生;(2)bax亞家族，成員有bax、bak及bok，主要促進細胞凋亡的發生;(3)bcl-2同源結構域-BH3亞家族，成員有bik、blk、bad和bid等，主要促進細胞凋亡。

凋亡刺激信號激活bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白bax、bak和bid，誘導線粒體中的細胞色素C釋放到細胞質，激活內源性細胞凋亡通路，細胞色素C同細胞質中凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結合，然后同caspase-9前體形成凋亡小體，在凋亡小體中caspase9前體被激活，活化的caspase-9激活caspase-3和7，通過分解細胞內蛋白誘導細胞凋亡。

bcl-2(又稱B細胞淋巴瘤/白血病-2)，是從小鼠細胞淋巴瘤中分離出的一種原癌基因，表達產物是bcl-2 蛋白，分子量為 25kDa［8］，主要位于核膜上，在內質網、線粒體膜上也有分布，通過抑制線粒體膜上轉變孔的開放而調節其通透性，從而抑制細胞色素C及其他促凋亡蛋白釋放到線粒體膜外，不能激活caspase，最終抑制細胞凋亡的發生。在凋亡級聯反應中bcl-2蛋白的下游是caspase(半胱天冬酶)［9］。

caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，被稱為死亡蛋白酶，其中C代表它具有半胱氨酸(cysteine)蛋白酶活性，aspase代表它具有在天冬氨酸(aspartic-acid)之后切割蛋白的能力。caspase全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶。它們以不活躍的形式(pro-caspase)或酶原的形式存在細胞中。它們的活性位點均含有半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。酶原的氨基端有一段被稱為“原結構域”(pro-domain)的序列，酶原活化時將原結構域切除，同時分成小片段(12kDa)和(17kDa)兩個亞型才能有效。其表達上調表明凋亡通路被激活，細胞死亡增加。海馬神經元的形成對于學習和記憶很重要［10］。海馬形成的幾個亞區CA1和CA3包括豐富的錐體細胞，DG區由幾層小顆粒細胞組成［11］。小鼠海馬CA1區神經元在孕第15～16天形成;CA3神經元在孕14～15d形成［12］。DG區顆粒細胞層在孕 20d時開始形成［13］，新生兒期小鼠缺血缺氧所導致的神經元死亡多發生在海馬的CA1和CA3區，同時在顆粒細胞層和齒狀門處也可見到。馬金龍［14］在高溫致神經管畸形的研究中發現高溫能干擾bcl-2和bax的表達，誘發神經上皮的凋亡，導致神經管畸形的發生。王瑩［15］等的研究表明，孕鼠注射海洛因后可引起子代小鼠海馬caspase-3和bax表達上調，bcl-2表達下調，線粒體凋亡通路可能參與了海洛因損傷小鼠神經行為發育的分子機制。Nasiraei-Moghadam S［16］等在孕鼠暴露于嗎啡的研究中顯示在胚胎發育的第一時期給予嗎啡干預，通過上調bax/bcl-2蛋白的比值及其下游caspase-3的活化而增加神經細胞凋亡的敏感性。

本研究中觀察到大鼠懷孕后其癇性發作的程度降低，可能是孕激素能夠抑制癇性發作。Western blot結果顯示，癲癇組子代海馬神經元中caspase-3蛋白、bax蛋白表達較空白對照組及假手術組增加;而bcl-2蛋白較空白對照組及假手術組降低，caspase-3、bax及bcl-2蛋白在空白對照組及假手術組中表達無差異，說明孕期每日腹腔刺激孕鼠對胚胎沒有影響。孕期癇性發作后由于缺氧或酸中毒等刺激及孕期抽搐后孕鼠體內的激素水平發生變化，均可能激活子代海馬神經元細胞凋亡程序，使海馬神經元凋亡增加。以上結果說明癲癇組孕期癇性發作可能影響子代海馬神經元發育以及使子代海馬神經元凋亡增加。

綜上所述，孕期癇性發作使子鼠海馬促凋亡蛋白bax表達增加，抑凋亡蛋白bcl-2表達降低，凋亡執行蛋白caspase-3表達增加。推測孕期癇性發作能使海馬神經元凋亡增加，從而導致海馬的形態結構異常，進而可能影響子代的學習記憶功能。

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