通腦活絡針刺法對大鼠急性腦梗死細胞凋亡及梗死容積的影響

張臻年， 李繼英， 趙 楊， 王敬卿， 范剛啟， 黃 遲， 張 暉， 劉孔江

隨著缺血半暗帶和遲發性神經元死亡學說的問世，人們發現及時抑制神經細胞凋亡是減輕腦缺血再灌注損傷的關鍵。腦缺血后，若能及時采取腦保護措施，則能抑制死亡基因的作用，加強存活基因的功能，因此尋找抑制神經細胞凋亡的干預措施將為腦缺血的治療開拓思路［1］。然而目前的抗凋亡藥物多為多肽大分子，難以通過血腦屏障，又有較大副作用，而傳統的針刺方法具有雙向調節作用，安全性較高。南京市中醫院腦病科曾于2003年采用通腦活絡針刺療法對急性腦梗死做過臨床和實驗研究，取得較好療效［2］，2006年1月～2009年10月，我們聯合江蘇省10家三甲級醫院采用該法治療腦梗死亦取得較好療效［3，4］，本實驗試圖從分子機制探討該法治療急性腦梗死的神經保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組 12月齡SD大鼠，雄性，體重280～300g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號SCXK(滬)2007-0005。使用南京中醫藥大學實驗動物中心SPF級實驗室，實驗動物使用許可證SYXK(蘇)2007-0030。

將264只造模成功后雄性SD大鼠隨機分為11組，分別為(1):發病時間≤1.5h組共72例，其中通腦活絡針刺(針刺)組24例、溶栓組24例、體針治療(體針)組24例;(2)發病時間1.5～2h組共72例，其中通腦活絡針刺組(針刺)24例、溶栓組24例、體針治療組(體針)24例;(3)發病時間2～3h組共72例，其中通腦活絡針刺組(針刺)24例、溶栓組24例、體針治療組(體針)24例。并設缺血對照組和假手術組各24例。每組分別于24h、72h各隨機處死一批，每批為12只，隨機分為兩組，一組予TTC染色測梗死容積百分比;另一組予HE染色在光鏡下觀察組織病理形態學變化，用TUNEL法原位標記DNA片段檢測凋亡細胞計數。

1.2 處理方法 通腦活絡針刺法即頭針+體針:頭針:百會、雙側風池、人中、太陽、后頂、病灶側運動區;體針:屈池、合谷、足三里、三陰交。取穴參照中國針灸學會實驗研究會1992年制定的《實驗動物穴位定位標準》，每日一次，每次留針30min，每針捻轉100轉/分，捻2次(進針后、出針前)，各1min;溶栓:大腦中動脈梗死后在規定時間內按10000U/Kg尿激酶在20min內從尾靜脈緩慢注射。

1.3 試劑和藥品 四氮唑紅(TTC)由上海化學試劑總廠生產，批號20060927;0.8%戊巴比妥鈉由上海西唐生物科技公司生產，批號20070302;尿激酶由天津生物化學制藥廠生產，規格為10000U/支，批號20070505;TUNEL細胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 栓子制備 參考 Bednar［5］和 Sereghy［6］的方法制備栓子。在環境溫度為22℃ ～27℃下，另選健康大鼠用0.8%戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，分離出股動脈、股靜脈。向股動脈刺入長10cm，外徑0.7mm的PE管(polyethylene tubing)套取動脈血。所取血樣在22℃ ～27℃下放置2h后，再放入4℃冷藏室22h，然后將血樣推入盛有生理鹽水消毒彎盤中，吸入長20cm外徑0.7mm的PE管連續反復在管中推、吸5min(約200次)后，將栓子再推入彎盤中，截成1μl栓子，最后吸入充滿生理鹽水的外徑0.35mm的PE管中，待用。

1.4.2 腦缺血動物模型建立的手術操作 在環境溫度為22℃ ～27℃下，用0.8%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。取頸正中切口切開皮膚及皮下組織，分離右側頸總動脈，充分暴露頸動脈三角、頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)及其分支，將動脈與周圍的神經、筋膜細心游離開。燒灼斷頸外動脈各分支包括:甲狀腺上動脈、咽升動脈、枕動脈，游離ICA并牽拉開二腹肌肌腹，暴露翼腭動脈，在翼腭動脈起始處以絲線結扎。以動脈夾關閉 CCA近端、ICA遠端;以絲線結扎ECA遠端，斷開ECA;將ECA殘段拉向ICA一致的方向，使ICA、ECA呈直線，向頸外動脈殘段內送入已經含有栓子和生理鹽水混懸液的外徑0.35mm的PE管，將其小心一直送入ICA內;繼而開放ICA并向ICA內推入栓子和生理鹽水混懸液2～5μl，確定栓子已順利推入后，隨即一邊退PE管一邊再用動脈夾關閉ICA，然后拔除PE管、結扎ECA殘段根部。最后依次開放CCA、ICA的動脈夾;記錄栓塞時間。生理鹽水沖洗局部后全層連續縫合切口。假手術組不推入栓子，而僅推入5μl生理鹽水。

1.4.3 根據典型表現判斷模型是否成功 典型神經癥狀表現為精神萎靡，同側霍納氏癥，對側前肢下垂，內收內旋，并自發性向患側轉圈。術后觀察癥狀，1～2h內有典型神經癥狀出現則為造模成功;2h內無典型神經癥狀出現則造模失敗，將此例動物剔除。除假手術組外，所有入組大鼠均用造模成功大鼠完成。

1.5 神經功能缺損檢測評分 按 Longa［7，8］等的方法，在栓塞后不同時間，對動物進行5分制神經行為學評分。標準如下:(1)無神經功能損傷，計0分;(2)不能完全伸展左前肢，提鼠尾離開地面約30cm時，左前肢表現為腕屈曲、肘屈曲、肩內旋或兼而有之者，計1分;(3)自發向左側轉圈，計2分;(4)將動物置于光滑平面上，行走時向左側傾倒，或輕推肩部時即向左側傾倒，計3分;(5)不能自發行走，或意識喪失，計4分，分數越高，動物的行為障礙越嚴重。

1.6 TUNEL法測凋亡細胞計數 TUNEL細胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供。試劑1:酶濃縮溶液(EnzymeSolution);試劑2:標記溶液(Lable Solution);試劑 3:轉化劑-POD(Converter-POD)、酶標記抗熒光素抗體(即用型)。用光學顯微鏡(×400)觀察每個視野中陽性細胞數目(細胞核呈深藍色者為陽性細胞)，每組隨機計數5個視野，取其均值作為本組的代表值。

1.7 腦組織梗死容積百分比測定 參考Swanson 等［9，10］方法全部存活動物均在栓塞后規定時間斷頭取腦;去除嗅部、小腦、低位腦干，取腦組織時注意觀察有無蛛網膜下腔出血，腦組織取出后即置于-22℃低溫冰箱快速冷凍后，由前向后每隔2mm切取組織片共6片，置2%氯化-2，3-5三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中 37℃孵育20～25min，待完全顯色后置福爾馬林液固定。染色后正常組織為紅色，腦梗死組織為白色，福爾馬林液固定后6h將腦片平面置于刻度紙上，用相機照相后輸入計算機，采用Photoshop及Autocad軟件計算每片梗死面積;然后按公式V=Sd/T(S為每一腦片梗死灶面積，d為腦片厚度，T為線形放大倍數)計算每一腦梗死容積，對其不顯色部分經圖像分析系統處理后計算其梗死容積(mm3)，并求出同側半球的容積，求出二者容積之比即為梗死容積百分比。

1.8 組織病理學檢查 各組大鼠于術后24h、72h斷頭取腦，取視交叉至視交叉前3mm的切片，以10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理形態學變化。

1.9 統計學分析 所有實驗數據經反復核查后用SPSS13.0統計軟件處理，定量資料用均數±標準差(±s)表示，多組間的比較用單因素方差分析;各處理組間的兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 腦梗死后動物存活情況 除假手術組在規定時間內無死亡外，其余各組均有大鼠在規定時間內死亡。針刺組共死亡5例，其中6h死亡2例、24h死亡2例、72h死亡1例;溶栓組共死亡13例，其中6h死亡8例、24h死亡4例、72h死亡1例;體針組共死亡8例，其中6h死亡3例、24h死亡3例、72h死亡2例;缺血對照組共死亡9例，其中6h死亡4例、24h死亡3例、72h死亡2例。

2.2 各組TUNEL凋亡細胞計數表達情況(見表1) 發病≤1.5h時間窗內:針刺組、溶栓組差異無統計學意義(P=0.814＞0.05)，兩者均優于體針組(P ＜0.01)及缺血對照組(P ＜0.01)。發病 1.5～2h時間窗內:針刺組、溶栓組差異亦無統計學意義(P=0.291＞0.05)，兩者均優于體針組(P ＜0.01)及缺血對照組(P＜0.01)。發病2～3h時間窗內:針刺組仍顯著優于溶栓組、體針組及缺血對照組(P＜0.01)，但溶栓組、體針組及缺血對照組各組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。24h時點、72h時點，≤1.5h針刺組、1.5～2h針刺組、2～3h針刺組及缺血對照組各組凋亡細胞計數比較差異均有統計學意義(P ＜0.01)。

2.3 TTC染色后各組梗死容積百分比比較(見表2) 發病≤1.5h時間窗內:針刺組、溶栓組差異無統計學意義(P=0.494＞0.05)，兩者均優于體針組和缺血對照組(P＜0.01)，體針組優于缺血對照組(P ＜0.01)。發病1.5 ～2h時間窗內:針刺組、溶栓組差異無統計學意義(P=0.553＞0.05)，兩者均優于體針組和缺血對照組(P＜0.01)，體針組優于缺血對照組(P=0.011＜0.05)。發病2～3h時間窗內:針刺組優于溶栓組、體針組及缺血對照組(P＜0.01)，但溶栓組、體針組及缺血對照組各組間比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。24h時點、72h時點，≤1.5h針刺組、1.5～2h針刺組、2～3h針刺組及缺血對照組各組梗死容積百分比比較差異均有統計學意義(P ＜0.01)。

2.4 組織病理學變化 A組(≤1.5h針刺組)可見神經纖維排列略紊亂，少量核固縮(見圖1);B組(≤1.5h溶栓組)可見神經細胞腫脹、少量核固縮、間質水腫、灶性出血(見圖2);C組(≤1.5h體針組)壞死較A組明顯，神經細胞顯著減少，核固縮(見圖3);D組(1.5～2h針刺組)可見小灶性壞死，神經膠質增生，排列紊亂(見圖4);E組(1.5～2h溶栓組)可見局部壞死伴少量出血及炎細胞浸潤，神經纖維疏松，神經膠質增生，排列紊亂(見圖5);F組(1.5～2h體針組)可見壞死較C組明顯，神經細胞顯著減少，核固縮(見圖6);G組(2～3h針刺組)可見壞死較A、D組明顯并伴中等炎細胞浸潤(見圖7);H組(2～3h溶栓組)神經細胞腫脹，灶性壞死，伴炎細胞浸潤，少量核固縮，間質水腫，灶性出血(見圖8);I組(2～3h體針組)壞死較C、F組明顯并伴中等炎細胞浸潤(見圖9);J組(缺血對照組)見到明顯梗死灶位于大腦皮質及基底節區，大片壞死組織中見神經元和膠質細胞腫脹或消失，核固縮或核膜破裂，結構消失，均質化改變，梗死灶周圍半暗帶區見大量炎細胞浸潤、核固縮濃染的細胞，血管內皮腫脹(見圖10);K組(假手術組)無梗死灶，神經元及神經纖維結構形態正常，間質致密無水腫。均在HE染色后用光學顯微鏡(×400)進行觀察。

表1 各組TUNEL凋亡細胞計數表達觀察(±s)（個/400倍）

表1 各組TUNEL凋亡細胞計數表達觀察(±s)（個/400倍）

與同時點體針組比較*P＜0.01;與缺血對照組比較△P＜0.01;針刺組與1.5～2h亞組比較☆P ＜0.01;與2 ～3h亞組比較▲P ＜0.01;針刺與溶栓組比較★P ＜0.05

組別 例數24h 72h發病≤1.5h針刺溶栓體針發病1.5～2h針刺溶栓體針發病2～3h針刺溶栓體針缺血12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 22.38 ±2.30 21.91 ±3.44 45.57 ±2.57 35.67 ±3.34 36.08 ±4.54 49.89 ±2.38 47.33 ±1.58 55.40 ±2.14 55.91 ±2.63 56.20 ±2.97 32.31 ±4.72＊△☆▲31.76 ±4.26＊△50.50 ±2.33△45.28 ±3.54＊△▲47.31 ±2.40＊△54.96 ±2.68△53.35 ±3.36＊△★68.08 ±3.77 67.37 ±4.48 67.97 ±4.09

表2 TTC染色后各組梗死容積百分比比較(±s)(%)

表2 TTC染色后各組梗死容積百分比比較(±s)(%)

與同時點體針組比較*P＜0.01;與缺血對照組比較△P＜0.01;針刺組與1.5～2h亞組比較☆P ＜0.01;與2 ～3h亞組比較▲P ＜0.01;針刺與溶栓組比較★P ＜0.05

組別 例數24h 72h發病≤1.5h針刺溶栓體針發病1.5～2h針刺溶栓體針發病2～3h針刺溶栓體針缺血12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 10.30 ±2.31☆▲9.64 ±2.18 14.31 ±2.26 14.74 ±2.23▲13.60 ±2.37 17.39 ±2.26 17.29 ±2.38 19.64 ±2.26 21.49 ±1.54 20.55 ±2.36 12.62 ±2.35＊△☆▲11.68 ±2.26＊△20.63 ±2.37△16.54 ±2.33＊△▲15.71 ±2.29＊△25.46 ±2.55△20.59 ±2.39＊△★28.34 ±2.26 29.42 ±2.19 29.31 ±2.36

3 討論

本研究利用SD大鼠制作的大腦中動脈血栓栓塞性腦梗死動物模型對通腦活絡針刺法治療急性腦梗死的機制進行了研究，證實了通腦活絡針刺法對急性腦梗死大鼠具有治療和腦保護作用。

通腦活絡針刺法中雙側太陽穴是額、顳、蝶骨匯集的翼點，此處是人體顱骨骨質最薄處。后頂穴是嬰兒期后囟骨化前的位置。從風池穴進針，針尖對準對側下眼眶，正是瞄準了調節大腦前后循環的Willis’環［11］。百會位居高端，有統領百脈、平沖降逆的作用。通腦活絡針刺法的諸多穴位在顱頂形成一個立體網絡，我們在這些主穴上施加較強針感，通過循經傳感作用，可能緩解梗死始動期血流動力學的紊亂，恢復半暗帶的血供，降低凋亡細胞計數及大鼠急性腦梗死時的梗死容積，逆轉腦梗死進程。

腦缺血后神經元死亡是一個極其復雜的病理過程。研究結果表明缺血后神經元死亡主要表現為壞死和凋亡兩種形式，分別涉及主動和被動細胞死亡機制。在腦缺血急性期，神經元壞死與凋亡并存，細胞壞死位于缺血中心區，細胞凋亡主要出現在缺血半暗帶;而在腦缺血的遲發性神經元死亡期，則以細胞凋亡為主，凋亡可能決定了最終梗死體積。TTC與完整的線粒體氧化酶系反應，誘發產生深紅色、光酶脂溶性的Formazan而使正常組織染色，缺血組織的線粒體損傷，不能誘導染色反應而呈白色，容易鑒別［12］。本實驗采用目前已被國內外學者普遍采用的TTC作為梗死區域的檢測標記［13，14］，觀察的腦梗死灶呈蒼白色與MCA支配的腦區域一致，未缺血部分呈紅色，證實模型制作成功。本實驗所觀察到針刺治療可明顯緩解和減輕腦梗死的病理過程。腦缺血區組織病理學變化如同以往作者的報道，大腦中動脈供血區的大腦皮質和尾殼核的外側區明顯增厚，腦室擴大，神經元腫脹和壞死。此類變化持續到腦缺血3d，此時出現大量神經元死亡，Garcia等［15］對此漸進性的病理變化作了詳盡的觀察，并認為這是由腦缺血發展成腦梗死的病理過程。

從上述實驗結果可以得出以下結論:(1)在有效時間窗內(小于2h)，針刺組與溶栓組在降低梗死容積百分比、降低凋亡細胞計數方面，差異無統計學意義(P＞0.05);(2)在2～3h時間段以內，通腦活絡針刺組對上述指標的改善優于缺血對照組(P＜0.05)，而溶栓組和缺血對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，說明通腦活絡針刺法較溶栓治療延長了治療時間窗，同時提示通腦活絡針刺療法的療效和時間窗相關;(3)溶栓治療超過2h則無明顯效果，且明顯增加出血率，今后可進一步擴大樣本量對大鼠溶栓時間窗進行研究;(4)本實驗中對梗死容積百分比、凋亡細胞計數的觀察時點只設在24h、72h，若另設48h、7d為觀察時點，則更有利于觀察上述指標的動態變化，將更為詳盡的闡釋急性腦梗死的病理生理變化;(5)今后研究的重點可進一步擴大針刺干預的時間至4h、5h、6h等，以進一步為通腦活絡針刺法治療急性腦梗死的時間窗問題上提供更為詳實的實驗依據;(6)通腦活絡針刺法可能通過在一定范圍內下調凋亡細胞的表達，保護缺血再灌注損傷中的腦組織，從而達到腦缺血后神經功能修復與重建的作用。

圖1 神經纖維排列略紊亂，少量核固縮;圖2 神經細胞腫脹，灶性出血;圖3 神經細胞減少，核固縮;圖4 小灶性壞死，神經膠質增生;圖5 局部壞死伴少量出血

圖6 神經細胞顯著減少，核固縮;圖7 壞死較明顯并伴中等炎細胞浸潤;圖8 灶性壞死、間質水腫伴灶性出血;圖9 壞死明顯并伴炎細胞浸潤;圖10 大量炎細胞浸潤、核固縮

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